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优化设计的内切葡聚糖酶基因Ends在毕赤巴斯德酵母中的表达研究

作　者: 廖俊华
导　师: 陈惠
学　校: 四川农业大学
专　业: 生物物理学
关键词: 内切葡聚糖酶毕赤酵母优化设计基因表达酶活力
分类号: Q784
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

纤维素酶是一种复合酶,根据各酶功能不同,可分为三类：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。纤维素酶是糖苷水解酶的一种,它可以将纤维素物质水解成单糖,进而发酵产生乙醇,从而解决农业、再生能源以及环境污染等问题。此外,纤维素酶在纺织、食品、饲料和制药行业等领域均具有广泛的应用。纤维素酶在实际应用中取得的成效与预期的目标相距甚远,主要是因为纤维素酶活性不高,因此提高纤维素酶的产量,降低生产成本成为当务之急。随着对纤维素酶研究的不断深入,生物化学、分子生物学以及基因工程等多种交叉学科的快速发展,获得适合工业化生产的高比活力的纤维素酶已指日可待。为提高纤维素酶的产量,本论文根据毕赤酵母的偏爱密码子,在不改变内切葡聚糖酶氨基酸序列的前提下,利用分子生物学软件DNAstars、Rensselaer-Wadsworth Bioinformatics Center (BiC)(www.bioinfo.rpi.edu)生物学信息中心在线RNA折叠软件Mfold程序对内切葡聚糖酶基因的碱基含量、mRNA自由能△G、二级结构等生物学信息进行分析,将低频密码子替换为高频密码子,获得优化设计的基因。本课题组从成功克隆的枯草芽孢杆菌C-36内切葡聚糖酶基因End(Genbank登录号：DQ782954)出发,对去掉信号肽的End基因进行生物学分析。分析表明该基因全长1413 bp,编码470个氨基酸成熟肽。其中(G+C)%含量为44.70%,密码子第三位(G+C)%碱基含量为44.40%；加上巴斯德毕赤酵母α因子信号肽后(G+C)%为44.00%,密码子第三位(G+C)%碱基含量为42.00%。对End基因mRNA分析表明,折叠后最小自由能△G=-555.40 kcal/mol。根据巴斯德毕赤酵母密码子偏爱性,去除内切葡聚糖酶基因中酵母表达低频密码子,替换为高频密码子,获得能在毕赤酵母中高效表达的内切葡聚糖酶优化基因Ends,长度为1413 bp。改造后基因Ends与End的同源率为87.90%,(G+C)%为45.00%,密码子第三位(G+C)%碱基含量为50.50%。加上巴斯德毕赤酵母α因子信号肽后(G+C)%为44.30%,密码子第三位(G+C)%碱基含量为47.10%。对Ends基因mRNA分析表明,折叠后最小自由能△G=-548.90 kcal/mol。优化设计的End基因克隆及测序后,构建了优化内切葡聚糖酶的表达载体pPIC9K-Ends,获得含重组质粒pPIC9K-Ends的大肠杆菌DH5α。用含氨苄青霉素的液体培养基过夜培养阳性大肠杆菌DH5α,收集菌体,提取并纯化回收质粒pPIC9K-Ends。质粒pPIC9K-Ends经SalⅠ线性化后,电转化酵母GS115,经MM和MD平板筛选后,同时采用酵母总DNA的PCR鉴定和酶活测定的方法,筛选出阳性转化子,实现Ends基因在酵母中的分泌表达。工程菌pPIC9k-Ends-19在优化培养后,酶活达1034.7 U,比未改造的阳性菌株(P.pastoris GS115 pPIC-End)提高了1.2倍,经G418抗性筛选,确定pPIC9k-Ends-19为单拷贝转化子。SDS-PAGE分析显示Ends基因与End基因产物的分子量都为79.82 KD。经研究表明,优化后的基因Ends与未优化的基因End在毕赤巴斯德酵母中表达产物酶学性质一致。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-8
目录  8-10
1.前言  10-19
  1.1 纤维素酶的概述  10-13
    1.1.1 纤维素酶系的组成及作用  10
    1.1.2 纤维素酶的作用机理  10-11
    1.1.3 纤维素酶的来源  11-12
    1.1.4 纤维素酶的应用  12-13
  1.2 巴斯德毕赤酵母表达系统  13-15
    1.2.1 巴斯德毕赤酵母系统的优点  13-14
    1.2.2 外源基因在毕赤酵母表达系统中的表达  14-15
  1.3 密码子优化的理论依据  15-17
  1.4 优化设计基因的策略及其在毕赤酵母中表达的研究进展  17-18
  1.5 本研究的前期工作、目的和意义  18-19
2.实验材料  19-24
  2.1 质粒与菌株  19-20
  2.2 主要仪器  20
  2.3 主要试剂  20-21
  2.4 培养基  21
  2.5 纤维素酶活力测定溶液  21-22
  2.6 SDS-PAGE电泳药品及试剂  22-24
3.实验方法  24-32
  3.1 内切葡聚糖酶基因的改造  24
    3.1.1 选用分析软件并确定优化方案  24
    3.1.2 优化设计内切葡聚糖酶基因的人工合成  24
  3.2 引物的设计  24-25
  3.3 优化内切葡聚糖酶基因表达载体的构建  25-27
    3.3.1 优化内切葡聚糖酶基因Ends的获得  25
    3.3.2 表达载体DNA的处理  25-26
    3.3.3 重组质粒pPIC9K- Ends的连接  26
    3.3.4 重组质粒pPIC9K- Ends的转化  26-27
    3.3.5 阳性克隆菌株的筛选及鉴定  27
  3.4.表达载体pPIC9K- Ends的电击转化  27-28
    3.4.1 酵母GS115感受态细胞的制备  27-28
    3.4.2 表达载体pPIC9K- Ends的线性化处理  28
    3.4.3 pPIC9K- Ends的电击转化  28
  3.5 重组转化子的筛选  28-29
  3.6 优化内切葡聚糖酶Ends基因在毕赤巴斯德酵母中的表达  29-32
    3.6.1 转化子的诱导培养  29
    3.6.2 转化子的诱导培养表达产物内切葡聚糖酶的活性测定  29-30
    3.7.2 最高酶活基因工程菌拷贝数的确定  30-32
4.结果  32-43
  4.1 优化基因方案的确定  32-33
  4.2 内切葡聚糖酶基因End与Ends的生物信息学分析  33-37
    4.2.1 碱基含量及密码子分布情况  33-34
    4.2.2 mRNA最小自由能及二级结构图  34-35
    4.2.3 基因End与Ends序列的比对  35-37
  4.3 表达载体pPIC9K- Ends的E.coli DH5α克隆阳性菌落的PCR筛选  37-38
  4.4 内切葡聚糖酶Ends基因表达载体pPIC9K- Ends的鉴定  38
  4.5 重组载体pPIC9K- Ends的转化及重组酵母的筛选  38-39
  4.6 内切葡聚糖酶Ends基因在毕赤巴斯德酵母中的诱导表达  39-40
  4.7 不同诱导时间酶活的测定及拷贝数、酶稳定性的确定  40-41
    4.7.1 诱导时间对酶活的影响  40
    4.7.2 pPIC9k-Ends-19中Ends基因拷贝数的确定  40-41
    4.7.3 温度对pPIC9k-Ends-19所产酶稳定性的影响  41
  4.8 表达产物的SDS-PAGE分析  41-42
  4.9 重组酵母的遗传稳定性检测  42-43
5.讨论  43-45
  5.1 优化设计基因的理论依据  43
  5.2 优化设计的内切葡聚糖酶基因Ends  43-44
  5.3 影响外源基因在毕赤酵母中高效表达的因素  44-45
  5.4 酶学性质讨论  45
6 结论  45-46
参考文献  46-52
致谢  52-53
攻读硕士期间发表的论文  53

优化设计的内切葡聚糖酶基因Ends在毕赤巴斯德酵母中的表达研究

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