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砀山酥梨果实PAL酶学特性的研究及PAL基因克隆

作　者: 张士鸿
导　师: 蔡永萍
学　校: 安徽农业大学
专　业: 植物学
关键词: 砀山酥梨果实 石细胞 木质素 PAL 酶学特性 RT-PCR 序列分析
分类号: S661.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


砀山酥梨（Pyrus bretschneideri cv.）原产安徽省砀山县,是我国梨的主栽品种和主要出口品种之一。但是由于近年来管理不善、品种退化等原因,使得石细胞含量明显增加,肉质变粗、多渣,口感变差,严重降低了砀山酥梨的品质及其经济价值。因此,通过生物学等手段降低石细胞含量,提高砀山酥梨品质,以增强砀山酥梨市场竞争力成为亟待解决的问题。本实验以砀山酥梨果实为材料,研究砀山酥梨果实发育过程中石细胞含量、木质素含量及木质素合成关键酶苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性变化,找到梨石细胞发育与PAL的关系。并对PAL的酶学特性进行研究,以期了解梨PAL的性质,同时克隆PAL基因,为从生理生化及分子生物学水平调控砀山酥梨石细胞发育提供理论基础,主要研究结果如下:1、通过对五种梨果实切片观察发现砀山酥梨、贡梨和丰水梨石细胞团较大,分布较密集;砀山酥梨石细胞团最大,分布最密集;库尔勒香梨石细胞团较小,分布较疏散。苹果梨,石细胞团最小,分布最疏散。2、在砀山酥梨果实整个发育过程中,石细胞含量于花后51天出现高峰,高峰值为17.83%;木质素含量于花后47天和花后63出现两个高峰,峰值分别为6.47%和7.00%;PAL活性最大值出现在花后27天,最大值为85.53∪/g·h。三者高峰期的出现在时间上表现出一定的时序性,PAL活性的高峰期最先出现,然后木质素含量出现高峰期,石细胞含量的高峰期最后出现。它们三者的变化趋势基本相同,总体上均呈先升高后下降的趋势,且三者之间均呈显著正相关。3、砀山酥梨果实PAL的最适pH为9.2;在pH9.0左右时稳定性较高;用pH4.0和pH10.0的缓冲液处理均导致酶分子结构发生变化,活性降低;PAL最适反应温度为60℃左右,较耐热;当反应时间在180min内PAL的活性与反应时间呈线性关系;PAL对L-苯丙氨酸有较高的专一性,对L-酪氨酸也表现出一定的活性;最适底物浓度为0.0004～0.0012mol/L;砀山酥梨果实PAL的Km值有两个,Km1为0.7500mmol/L,Km2为1.0690 mmol/L。4、克隆得到砀山酥梨果实PAL基因cDNA片段长度为585bp,推断编码195个氨基酸序列。该序列包含与其它植物PAL相同的活性催化位点,经序列分析和同源性比对,该氨基酸序列与其它植物PAL氨基酸序列的同源性在90%以上。系统进化树分析表明,砀山酥梨PAL氨基酸序列与蔷薇科的甜樱桃PAL氨基酸序列聚类关系最近。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-8
1 文献综述  8-15
  1.1 国内外研究动态  8-15
    1.1.1 石细胞与梨果实品质的关系  8-9
    1.1.2 梨石细胞的发育过程与木质素代谢  9-10
    1.1.3 苯丙氨酸解氨酶  10-11
    1.1.4 苯丙氨酸解氨酶的酶学性质  11-12
    1.1.5 梨属植物PAL 的研究进展  12
    1.1.6 苯丙氨酸解氨酶的基因结构  12-13
    1.1.7 苯丙氨酸解氨酶基因的克隆  13-15
2 引言  15-16
3 材料与方法  16-23
  3.1 实验材料  16
  3.2 实验设计  16
  3.3 主要试剂和仪器  16-17
    3.3.1 主要试剂  16-17
    3.3.2 主要仪器  17
  3.4 测定项目及方法  17-23
    3.4.1 切片观察梨果实石细胞团大小及间距  17
    3.4.2 石细胞含量的测定  17-18
    3.4.3 木质素含量的测定  18
    3.4.4 PAL 活性测定  18
    3.4.5 最适pH  18
    3.4.6 酸碱稳定性曲线  18
    3.4.7 pH耐受性  18
    3.4.8 最适温度  18-19
    3.4.9 温度耐受性  19
    3.4.10 最适底物浓度  19
    3.4.11 反应时间对PAL 活性的影响  19
    3.4.12 底物专一性研究  19
    3.4.13 砀山酥梨果实RNA的提取  19-20
    3.4.14 简并引物的设计  20
    3.4.15 cDNA第一链的合成  20-21
    3.4.16 PCR反应  21-22
    3.4.17 PCR产物的纯化回收  22
    3.4.18 产物测序  22-23
4 结果与分析  23-39
  4.1 不同品种梨果实石细胞团切片观察、大小及间距的比较  23-25
  4.2 砀山酥梨果实发育过程中石细胞、木质素含量与PAL 活性的变化  25-26
  4.3 砀山酥梨果实PAL 的酶学特性  26-32
    4.3.1 最适pH  26-27
    4.3.2 pH 耐受性及酸碱稳定性  27-28
    4.3.3 最适温度  28-29
    4.3.4 温度耐受性  29
    4.3.5 底物浓度对PAL 活性的影响  29-30
    4.3.6 Km 值  30-31
    4.3.7 反应时间对PAL 活性的影响  31
    4.3.8 底物专一性研究  31-32
  4.4 苯丙氨酸解氨酶PAL 基因的克隆  32-39
    4.4.1 砀山酥梨总RNA样品的电泳检测  32-33
    4.4.2 cDNA第一链电泳检测  33
    4.4.3 PCR扩增结果  33-34
    4.4.4 PCR产物的回收及测序结果  34-35
    4.4.5 砀山酥梨果实PAL氨基酸序列的同源性比较  35-37
    4.4.6 系统进化析  37-39
5 讨论  39-42
  5.1 不同品种梨果实石细胞团切片观察、大小及间距的比较  39
  5.2 砀山酥梨石细胞、木质素、PAL 之间的关系  39-40
  5.3 PAL 的酶学特性  40
  5.4 PAL 基因的克隆  40-42
6 结论  42-43
参考文献  43-48
附录  48-49
致谢  49-50
作者简介  50

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 仁果类 > 梨
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