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猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白亲和肽筛选与鉴定

作　者: 王明翠
导　师: 李广兴
学　校: 东北农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: PRRSV GP5蛋白 噬菌体技术 免疫学评价
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 77次
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内容摘要


本实验根据GenBank发表的PRRSV北美洲分离株(VR-2332)毒株的基因序列,利用Oligo和Primer 5.0软件设计了一对扩增GP5蛋白基因的引物。从疑似蓝耳病的猪内分离到PRRSV,在Marc-145细胞中盲传5-6代,出现较为明显的细胞病变,收获病毒液将其反复冻融3次进行病毒RNA的提取,反转录PCR,成功的扩增出全长为603个碱基的GP5基因片段。序列比较表明与已发表的VR-2332病毒毒株的GP5蛋白基因序列的同源率为91.5%;经BLAST搜索,扩增的GP5基因与CH-1α同源性最高,为99.2%。该毒株被命名为HH08。通过对PRRSV HH08株GP5基因序列分析,设计2对引物,通过PCR扩增获得了不含信号肽和跨膜功能区的GP5基因片段,长度分别为121bp和248bp。应用酶切位点相连构建融合基因技术,将两段基因亚克隆到原核表达载体中获得了重组质粒pET-GP5。构建的重组质粒在E.coli Rosetta中进行原核表达。SDS-PAGE结果表明有大小约为18 Ku的蛋白表达,与预计大小相符。Western-blot检测结果显示表达的蛋白能被天然PRRSV阳性猪血清所识别,同时此蛋白抑制PRRSV对Marc-145细胞的感染。将重组蛋白免疫新西兰白兔,制备多抗,经间接ELISA结果显示多抗血清效价可达217。将PRRSV HH08包被ELISA检测多抗血清的特异性,发现血清特异性较好,GP5蛋白血清具有抗中和病毒的活性,间接免疫荧光结果显示多抗血清能够用于PRRSV的特异性检测。利用噬菌体随机十二肽库,以GP5重组融合蛋白为靶分子,对其进行了四轮生物淘选。对第四轮洗脱物随机选出的20个噬菌体单克隆的核苷酸序列测定及多肽序列的推导结果表明,经过对靶分子的四轮筛选后,最终筛选出8种高亲和力的十二肽。将最高亲和力的2个序列进行合成,分别为KHMHWHPPALNT (K); HWGNHSKSHPQR (H)。竞争ELISA方法对合成多肽的检测结果说明多肽K、H均能与GP5重组蛋白结合。病毒抑制试验表明所筛选出的多肽具有良好的生物活性。为了检测多肽体内的抗病毒活性,本实验以BALB/c小鼠为试验动物,进行免疫学实验。将小鼠分成5组,即V+K组(病毒加K噬菌体组)、V+H组(病毒加H噬菌体组)、V+S组(病毒加对照S噬菌体组)、V组(病毒加PBS组)和C组(空白对照组)。首免PRRSVHH08株,24 h后分别免疫K、H、S噬菌体,免疫后在第7 d、14 d、21 d、28 d进行血液采集,ELISA方法检测小鼠血清样本中抗PRRSV及GP5蛋白的特异性抗体水平变化。ELISA方法检测抗体效价表明,V+K、V+H组抗PRRSV及GP5蛋白的特异性抗体水平低于V+S组、V+P组。表明噬菌体K、H在小鼠体内起到了中和病毒PRRSV的作用。本研究为防治PRRSV感染提供了实验数据。

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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