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猪主要RNA病毒病快速多联RT-PCR诊断技术研究

作　者: 路斌
导　师: 吴润；王一成
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪 CSFV PRRSV JEV 二温式PCR 多重实时荧光定量RT-PCR
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


【目的】运用PCR、RT-PCR和TaqMan（?）探针实时荧光定量RT-PCR建立猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征和猪脑炎单项与多重二温式PCR快速诊断技术、单项与多重实时荧光定量RT-PCR技术,为实验室快速诊断上述疫病提供新的快速诊断方法。【方法】（1）查询GenBank中注册的CSFV、PRRSV和JEV基因组核苷酸序列,通过序列比对,找出各病毒的保守区域,确定CSFV的NS5B基因、PRRSV的Nsp2基因和JEV的E基因为三者RNA病毒扩增的靶序列区域。以Primer Premier 5.0软件筛选设计符合多重RT-PCR要求的3对特异性引物,CSFV、PRRSV和JEV扩增片段分别为482bp、576bp和375bp。经PCR扩增条件优化,建立单项与多重二温式PCR快速诊断方法,以传统PCR检测方法验证。（2）根据TaqMan（?）探针实时荧光定量PCR反应原理,应用Primer Premier 5.0、Primer Express 3.0和Beacon Designer 4软件针对CSFV、PRRSV及JEV分别设计两对引物和一条特异性探针,报告集团依次为JOE、TAMARA和FAM。其中一对含有T7启动子序列上游引物,用于体外转录建立RNA标准品模板。用于实时荧光定量RT-PCR引物的扩增片段大小为101bp、78bp、94bp。经条件优化,建立CSFV、PRRSV及JEV单项与多重RQ-RT-PCR动力学扩增曲线和标准曲线,并通过敏感性试验、特异性试验、重复性试验及临床样品应用进行验证。【结果】（1）CSFV、PRRSV和JEV的基因目的片段扩增优化条件为:上下游引物浓度0.4μmol/L、Tm 58℃、2.5mmol/L dNTPs浓度200μmol/L、25mmol/L MgCl2浓度2.0mmol/L、rTaq DNA Polymerase（5U/μL）2.5U。建立了CSFV、PRRSV及JEV单项和多项二温式PCR快速诊断技术,最低检出量102 Copies/μL。特异性试验,仅CSFV、PRRSV及JEV可扩增出各自目的片段,PCV2、PRV、PPV、PEDV、TGEV等猪常见病毒均呈阴性。450份临床样品检测,与普通PCR的符合率分别为98%、100%和100%,节省时间在38%以上,可以在1h内完成快速检测。（2）成功建立CSFV、PRRSV和JEV三者TaqMan（?）探针法实时荧光定量RT-PCR检测技术,灵敏度可以达到10Copies/μL的体外转录RNA标准品,且动力学扩增曲线均匀平滑,标准曲线R2﹥0.99,具有良好的线性关系。PRRSV细胞毒敏感性试验显示,其敏感性可以达到10个TCID50。三者批内批间重复试验CV%均小于4%。（3）One Step RQ-RT-PCR可使检测过程在70min内完成,同时减少操作污染,有效控制假阳性。建立CSFV、PRRSV和JEV多重TaqMan探针法实时荧光定量RT-PCR检测技术,实现了在一个反应体系中对上述三者中任意两种或三种病原体同时进行定性、定量检测。【结论】（1）建立了CSFV、PRRSV及JEV单项和多项二温式PCR快速诊断技术,敏感性可达102 Copies/μL;（2）建立了CSFV、PRRSV及JEV单项和多重TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR快速诊断技术,敏感性为10Copies/μL,PRRSV（报告集团为FAM）单项实时荧光定量RT-PCR敏感性为10个TCID50,具有良好的稳定性和敏感性,为实验室快速诊断上述三种疫病提供方便。

全文目录


摘要  3-4
Summary  4-9
缩写词英汉对照表  9-11
第一章 绪论  11-20
  1 猪瘟诊断技术研究现状  11-13
    1.1 病原  11-12
    1.2 临床症状及病理变化  12
    1.3 诊断方法  12-13
      1.3.1 感染性病毒检测  12-13
      1.3.2 病毒抗原检测  13
      1.3.3 抗体检测  13
      1.3.4 分子生物学检测  13
  2 猪繁殖与呼吸综合征诊断技术研究现状  13-16
    2.1 病原  13-14
    2.2 临床症状及病理变化  14
    2.3 诊断方法  14-16
      2.3.1 病毒分离与鉴定  14
      2.3.2 抗原检测  14-15
      2.3.3 血清学检测  15-16
      2.3.4 分子生物学诊断技术  16
  3 猪乙型脑炎诊断技术研究现状  16-18
    3.1 病原  17
    3.2 临床症状及病理变化  17
    3.3 诊断方法  17-18
  4 PCR 诊断技术的发展和应用  18-19
  5 研究目的和意义  19
  6 研究内容和方法  19-20
    6.1 建立多重二温式PCR 检测方法  19
    6.2 建立One-Step TaqMan~((?))探针多重实时荧光定量RT-PCR 检测方法  19-20
第二章 CSFV、PRRSV 和JEV 单项二温式PCR 检测方法的建立  20-30
  1 材料与方法  20-25
    1.1 病毒、菌株、细胞和载体  20
    1.2 主要仪器与试剂  20-21
    1.3 引物设计与合成  21
    1.4 病毒核酸的提取及目的DNA 片段的克隆  21-23
      1.4.1 病毒基因组RNA 的提取  21-22
      1.4.2 病毒基因组DNA 的提取  22
      1.4.3 CSFV、PRRSV 和JEV cDNA 模板的制备  22
      1.4.4 CSFV、PRRSV 和JEV PCR 扩增反应及电泳成像  22
      1.4.5 PCR 产物胶回收纯化  22
      1.4.6 胶回收产物连接转化  22
      1.4.7 CaCl_2 法制备TOP 10 大肠杆菌感受态细胞  22-23
      1.4.8 连接产物转化  23
      1.4.9 菌落PCR 筛选阳性克隆及测序验证  23
      1.4.10 重组质粒模板标准品的制备  23
      1.4.11 重组质粒浓度的测定  23
    1.5 CSFV、PRRSV 和JEV 单项二温式PCR 反应条件的优化  23-24
      1.5.1 退火温度（Tm）  23
      1.5.2 引物浓度  23-24
      1.5.3 dNTPs 浓度  24
      1.5.4 MgC1_2 浓度  24
      1.5.5 rTaq DNA Polymerase 浓度的优化  24
    1.6 敏感性试验  24
    1.7 特异性试验  24-25
    1.8 临床病料验证  25
    1.9 与传统三阶温式PCR 检测法比较  25
  2 结果  25-28
    2.1 CSFV、PRRSV 和JEV 目的基因片段扩增  25
    2.2 CSFV、PRRSV 和JEV 单项二温式RT-PCR 反应优化条件  25-28
      2.2.1 退火温度（Tm）  25-26
      2.2.2 dNTPs 浓度  26
      2.2.3 MgC1_2 浓度  26-27
      2.2.4 rTaq DNA Polymerase 浓度  27
      2.2.5 敏感性试验  27
      2.2.6 特异性试验  27-28
      2.2.7 稳定性试验  28
      2.2.8 临床验证  28
      2.2.9 与传统PCR 检测法比较  28
  3 讨论  28-30
第三章 CSFV、PRRSV 和JEV 多重二温式PCR 检测方法的建立  30-36
  1 材料与方法  30-31
    1.1 多重二温式PCR 反应体系和反应条件优化  30-31
      1.1.1 退火温度（Tm）  30
      1.1.2 引物浓度  30-31
      1.1.3 Mg~(2+)浓度  31
      1.1.4 dNTPs 浓度  31
      1.1.5 rTaq DNA 聚合酶浓度  31
    1.2 敏感性试验  31
    1.3 特异性试验  31
    1.4 稳定性试验  31
    1.5 临床病料验证  31
  2 结果  31-34
    2.1 多重二温式RT-PCR 反应体系和反应条件优化  31-33
      2.1.1 CSFV 和PRRSV、PRRSV 和JEV 二重二温式PCR 反应体系和反应条件优化  31-32
      2.1.2 CSFV、PRRSV 和JEV 三重二温式RT-PCR 反应体系和反应条件优化  32-33
    2.2 多重二温式RT-PCR 敏感性试验  33
    2.3 多重二温式RT-PCR 特异性试验  33
    2.4 多重二温式RT-PCR 临床病料验证  33-34
  3 讨论  34-36
第四章 CSF、PRRS 及JE 单项实时荧光定量RT-PCR 诊断方法的建立  36-45
  1 材料与方法  36-39
    1.1 实时荧光定量RT-PCR 引物和探针的设计  36
    1.2 实时荧光定量RT-PCR 检测方法的建立  36-38
      1.2.1 病毒基因组RNA 的提取  36-37
      1.2.2 One-Step RT-PCR 扩增体外转录用目的DNA 片段与克隆  37-38
      1.2.3 体外转录RNA 模板标准品的制备  38
    1.3 一步法实时荧光定量RT-PCR 检测方法的建立  38-39
      1.3.1 特异性试验  38
      1.3.2 动力学扩增曲线及标准曲线的建立  38
      1.3.3 敏感性试验  38-39
      1.3.4 重复性和稳定性试验  39
      1.3.5 临床疑似病料检测  39
      1.3.6 PRRSV 阳性病料检测验证  39
  2 结果  39-43
    2.1 CSFV、PRRSV 及JEV 单项RQ-RT-PCR 动力学扩增曲线及标准曲线  39-40
    2.2 CSFV 敏感性试验  40-41
    2.3 重复性及稳定性试验  41
    2.4 特异性试验  41-43
    2.5 临床疑似病料检测  43
    2.6 PRRSV 阳性样品各脏器检出率及符合率  43
  3 讨论  43-45
第五章 CSF、PRRS 及JE 多重实时荧光定量RT-PCR 诊断方法的建立  45-51
  1 材料与方法  45-46
    1.1 实时荧光定量RT-PCR 检测方法的建立  45-46
      1.1.1 病毒基因组RNA 的提取  45
      1.1.2 One-Step RT-PCR 扩增用于体外转录的目的基因片段  45
      1.1.3 体外转录RNA 标准品模板的制备  45-46
    1.2 一步法实时荧光定量RT-PCR 检测方法的建立  46
  2 结果  46-50
    2.1 CSFV 和JEV 二重RQ-PCR 动力学扩增曲线  46
    2.2 CSFV 和JEV 二重RQ-PCR 敏感性及标准曲线  46-47
    2.3 PRRSV 和JEV 二重RQ-PCR 动力学扩增曲线  47
    2.4 CSFV 和PRRSV 二重RQ-PCR 动力学扩增曲线  47-48
    2.5 CSFV、PRRSV 和JEV 三重RQ-PCR 动力学扩增曲线  48-49
    2.6 CSFV、PRRSV 和JEV 三重RQ-PCR 敏感性试验  49-50
  3 讨论  50-51
结论  51-52
致谢  52-53
参考文献  53-59
作者简介  59-60
导师简介  60-61

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 猪
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