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HP-PRRSV GD株强弱毒株抗原在感染猪体内的动态分布研究

作　者: 孙丰廷
导　师: 毕丁仁；宁宜宝
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: HP-PRRSV 动态分布 RT-PCR FQRT-PCR
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

高致病性猪繁殖与呼吸综合征(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome, HP-PRRS)是由美洲型PRRSV高致病性变异毒株引起的一种急性高致死性疫病,自2006年爆发以来,给我国养殖业造成了非常严重的经济损失。近年来,国内新爆发和流行的高致病性PRRS,主要以高热、流产、高发病率和高死亡率为特征,是目前影响我国养猪业发展最重要的疾病之一目前,病毒基因亚型及血清型很多,同种但是不同致病力的病毒可以引起宿主靶细胞产生不同的应答反应。传统灭活苗的保护力往往十分有限,不能达到预防HP-PRRSV的效果。而新型弱毒疫苗保护的毒株和猪场的毒株不一定能形成交叉保护,即使基因型差异很小,这是当前防控PRRS的最大难题。因此进一步研究开发新型PRRS疫苗并制定出更加合理的防控方案对我国养猪产业意义重大。本实验通过比较几株美洲株序列,选取ORF6和ORF7阅读框内保守区域,设计引物和探针,建立RT-PCR方法和Taqman荧光定量PCR检测方法,结果显示特异性、敏感性均良好,荧光定量PCR方法比普通PCR方法敏感10-100倍作用。通过建立的RT-PCR方法和Taqman荧光定量检测方法研究本实验室培育的弱毒疫苗株GDr180株和强毒GD株F5代在感染40日龄仔猪后抗原在猪组织器官中的分布情况,以比较强弱毒株的组织嗜性差异,从而进一步揭示弱毒疫苗株的致病特性变化机理。结果显示强弱毒株在组织和器官中的分布情况差异显著,分布范围以及持续存留时间也有较大的不同。强毒株在第2周之前抗原分布范围最广,第2周之后分布范围明显减少；相对于强毒株而言,弱毒株感染后在组织中出现时间相对滞后,带毒时间主要集中在第2周至第3周之间,在第5周完全消失。从分布范围来看,强毒株的组织嗜性范围较广,而弱毒株仅限于肺脏及淋巴结等组织。说明强毒株在细胞传代过程中毒力下降的同时,组织嗜性的范围也明显缩小,这可能是病毒与细胞的长期相互适应有关。本实验对弱毒株GDr180不同免疫剂量刺激产生PRRSV抗体产生结果进行了检测,虽然用ELISA方法检测的是针对N蛋白的抗体,没有中和病毒的作用,但是与猪体内的免疫反应有很大相关性。对最佳免疫剂量的选择具有重要意义,但最佳的免疫剂量还有待于进一步的试验来确定。

全文目录

目录  4-6
摘要  6-7
ABSTRACT  7-9
缩略语表  9-11
1 文献综述  11-22
  1.1 PRRS概述  11
  1.2 PRRSV的分类与生物学特性  11-14
    1.2.1 PRRSV的分类  11-12
    1.2.2 PRRSV的生物学特性  12-14
  1.3 PRRSV的危害与流行病学  14-15
  1.4 PRRSV的诊断方法  15-17
    1.4.1 病原学诊断  15-16
    1.4.2 清学诊断  16-17
    1.4.3 RT-PCR方法  17
  1.5 PRRSV的综合防控措施  17-19
  1.6 新型疫苗研究进展  19-20
    1.6.1 基因疫苗  19
    1.6.2 重组冠状病毒  19
    1.6.3 重组杆状病毒  19
    1.6.4 重组腺病毒  19-20
  1.7 荧光定量PCR  20-22
    1.7.1 原理  20
    1.7.2 TaqMan荧光定量PCR技术特点  20-21
    1.7.3 荧光定量PCR的应用  21-22
2 研究目的与意义  22-23
3 材料与方法  23-39
  3.1 实验材料  23-24
    3.1.1 实验样品  23
    3.1.2 主要试剂  23
    3.1.3 主要仪器  23-24
  3.2 实验方法  24-39
    3.2.1 引物的设计与合成  24-26
    3.2.2 实验分组、接种和样品采集方案  26-27
    3.2.3 PRRS抗体检测和CSFV抗体检测  27-29
    3.2.4 TCID50试验测定的具体步骤  29
    3.2.5 PRRSV RT-PCR检测及核酸电泳  29-30
    3.2.6 RT-PCR特异性与敏感性实验  30
    3.2.7 荧光定量PCR方法标准质粒的构建  30-34
    3.2.8 荧光定量PCR方法的建立和优化  34-39
4 结果  39-47
  4.1 RT-PCR特异性与敏感性实验结果  39
    4.1.1 RT-PCR特异性检测结果  39
    4.1.2 RT-PCR敏感性检测结果  39
  4.2 RT-PCR方法对感染猪体内PRRSV抗原的动态分布检测  39-42
    4.2.1 强毒株GD株F5代感染猪各组织样品中PRRSV抗原检测结果  39-41
    4.2.2 弱毒株感染猪各组织样品中PRRSV抗原检测结果  41
    4.2.3 空白对照组剖解各组织PRRSV抗原检测结果  41-42
  4.3 实验猪临床症状  42-43
  4.4 弱毒株GDr180不同免疫剂量与抗体产生结果差异  43
  4.5 序列测定结果  43-44
  4.6 荧光定量PCR方法对感染猪体内抗原的动态分布检测  44-47
    4.6.1 强毒株GD株F5代剖解各组织抗原荧光定量检测结果  44-46
    4.6.2 弱毒株感染猪各组织样品中抗原荧光定量检测结果  46
    4.6.3 空白对照组剖解各组织PRRSV抗原检测结果  46-47
5 分析与讨论  47-49
  5.1 关于引物和探针的设计  47
  5.2 强毒株GD株F5代感染猪体内抗原动态分布  47
  5.3 弱毒株GDr180株感染猪体内抗原动态分布  47-48
  5.4 弱毒株GDr180不同免疫剂量与抗体产生的差异  48-49
6 结论  49-50
参考文献  50-55
致谢  55-56

HP-PRRSV GD株强弱毒株抗原在感染猪体内的动态分布研究

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