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犊牛腹泻主要病原菌毒力基因检测及其重组表达

作　者: 高立战
导　师: 冯书章
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 犊牛腹泻多重PCR 产肠毒性大肠杆菌重组抗原
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

犊牛腹泻是影响犊牛早期生长发育最为严重的疾病。大肠杆菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌是引起犊牛腹泻的主要病原菌，快速检测这三种病原菌并调查其流行的毒力基因尤为必要。本研究针对上述病原细菌建立三套多重PCR检测体系，检测了犊牛临床腹泻样品，并采用直接分离和生物过滤分离方法分离出毒力菌株。重点研究了产毒性大肠杆菌(enterotoxigenic E. coli, ETEC)主要毒力因子耐热肠毒素（Heat-stable toxin，ST）和不耐热肠毒素(Heat-labile toxin，LT)的基因克隆、表达，通过免疫学实验证明了重组抗原具有良好的抗原性。犊牛腹泻主要病原菌多重PCR检测方法的建立。为迅速检测犊牛腹泻的主要病原菌和分析其流行的毒力基因，建立了三套多重PCR检测体系：stx2-k99-f41-stx1、st-invA-eae-lt和cpb-plc-etx。stx2-k99-f41-stx1检测体系：实验选取ETEC的k99、f41基因，产志贺毒素大肠杆菌(Shiga toxin-producing E. coli, STEC)的stx2、stx1基因作为扩增靶基因，通过优化反应条件建立了四重PCR检测体系。对PCR产物回收、测序，验证PCR。多重PCR检测相关阳性菌株和阴性菌株的结果与其已知的基因背景一致。通过平板计数确定多重PCR对C83922、EDL933及其混合菌液能够检出的最小浓度分别为：1×104CFU/ml、5×103CFU/ml、2×104CFU/ml。st-invA-eae-lt检测体系：实验选取ETEC的st、lt基因，致病性大肠杆菌(enteropathogenic E. coli, EPEC)、出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic E. coli,EHEC)的eae基因同源区序列和沙门氏菌的invA基因作为扩增靶基因，通过优化反应条件建立了四重PCR检测体系。对PCR产物回收、测序，验证PCR。多重PCR检测相关阳性菌株和阴性菌株的结果与其已知的基因背景一致。通过平板计数确定多重PCR对C83922、EDL933、都伯林沙门菌、EWD299和它们混合菌液能够检出的最小浓度分别为：3×103CFU/ml、5×103CFU/ml、3×103CFU/ml、1×104CFU/ml和2×104CFU/ml。cpb-plc-etx检测体系：实验选取产气荚膜梭菌的cpb、plc、etx基因为扩增靶基因，通过优化反应条件建立了三重PCR检测体系。对PCR产物回收、测序，验证PCR。多重PCR检测相关阳性菌株和阴性菌株的结果与其已知的基因背景一致。通过平板计数确定多重PCR对B型产气荚膜梭菌能够检出的最小浓度为5×103CFU/ml。本研究表明犊牛腹泻主要病原菌的多重PCR检测方法具有快速、特异且敏感的特点，可用于犊牛腹泻的快速检测。临床样品的PCR检测与细菌分离鉴定。为了调查犊牛腹泻的主要病原菌及其流行的毒力基因，利用建立的三套多重PCR体系检测了59份犊牛腹泻样品，结果显示病原性大肠杆菌是引发犊牛腹泻的主要病原菌。通过直接分离和生物过滤法分离，均能够从样品中分离到毒力菌株。在样品T1、T2、XL1中分离到同时携带stx1和eae的大肠杆菌；在样品T3中分离到同时携带stx2、stx1、eae的大肠杆菌和携带plc的产气荚膜梭菌；在样品X1、X5中分离到携带lt的大肠杆菌；在样品X2、W1中分离到携带eae的大肠杆菌；在样品X4中分离到同时携带stx2、eae、stx1、st的大肠杆菌和携带plc的产气荚膜梭菌；在样品Q3、Q4中分离到携带stx2的大肠杆菌。大肠杆菌肠毒素ST、LTB融合基因的克隆、表达和免疫原性初步研究。ETEC是引发犊牛腹泻常见的主要病原菌，肠毒素ST、LT是其主要的毒力因子。实验用PCR的方式获得st和ltB基因序列，再用重叠PCR的方式获得其融合基因st-ltB，并在两者之间加入了编码柔性多肽G-G-G-S-G-G-G-S的Linker序列。将融合基因连接到pMD18-T载体上，再转化到DH5α中。再将融合基因从pMD18-T载体上酶切下来，连接到表达载体pMal-p2x上，转化到表达菌株Tb1中。采用超声破碎的方法获得可溶蛋白上清，以Tb1(pMal-p2x)为阴性对照进行SDS-PAGE检验，在62KD和83KD中间有一蛋白条带；用Anti-Cholera Toxins作为一抗血清(LTB与CTB的氨基酸有80%的同源性)，以羊抗兔IgG作二抗，免疫印迹检验结果为阳性，从而进一步证明了融合蛋白的表达。通过优化表达条件，最终确定IPTG终浓度为0.41mmol/L、31℃、诱导8h可以获得最大的表达量，目的蛋白约占可溶性蛋白总量的13.4%。使用Amylose柱亲和层析纯化目的蛋白。以纯化后的目的蛋白作为抗原腹腔注射小白鼠100μg/只，两周免疫一次，同时免疫7组小鼠，分别在一免之后的7d、14d，二免之后的7d、14d，三免之后的7d、14d、21d采血，制备待检血清。使用Xa因子蛋白酶切割MBP，以回收的ST-LTB多肽作为包被抗原，间接ELISA法测量抗体滴度，最高效价可达215。用免疫血清中和后的J13(ST+，LT+)培养上清给乳鼠灌胃，实验结果呈现阴性反应。体外中和实验证实融合蛋白具有良好的免疫原性。小鼠在三免之后的第7d，腹腔注射3倍MLD50剂量的J13，存活数为8/10，证实重组抗原具有良好的免疫保护作用。本研究表明，重组菌株Tb1(pMal-p2x::st-ltB)可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻的候选亚单位菌苗株。

全文目录

缩略词表  4-5
摘要  5-7
Abstract  7-9
前言  9-13
第一章犊牛腹泻主要病原菌多重PCR 检测方法的建立  13-26
  第一节多重PCR 检测大肠杆菌  13-17
    1 材料和方法  13-15
    2 结果  15-17
    3 讨论  17
  第二节多重PCR 检测沙门氏菌和大肠杆菌  17-21
    1 材料和方法  18-19
    2 结果  19-21
    3 讨论  21
  第三节多重PCR 检测产气荚膜梭菌  21-26
    1 材料和方法  22-23
    2 结果  23-25
    3 讨论  25-26
第二章犊牛细菌性腹泻样品检测与病原菌分离  26-31
  1 材料和方法  26-27
  2 结果  27-29
  3 讨论  29-31
第三章大肠杆菌肠毒素ST、LTB 融合基因表达及其免疫原性  31-47
  第一节大肠杆菌肠毒素ST、LTB 融合基因的构建及其表达  31-39
    1 材料和方法  31-36
    2 结果  36-38
    3 讨论  38-39
  第二节 ST-LTB 重组抗原的免疫原性初步研究  39-47
    1 材料和方法  39-42
    2 结果  42-45
    3 讨论  45-47
结论  47-48
参考文献  48-52
附录  52-64
综述犊牛腹泻主要病原菌研究进展  64
论著犊牛腹泻主要病原菌多重 PCR 方法的建立  64-73
个人简历  73-74
致谢  74

犊牛腹泻主要病原菌毒力基因检测及其重组表达

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