基于核酸适体识别和生物酶信号放大检测可卡因的研究

作　者: 孔建美
导　师: 杨秀英；马翠萍
学　校: 青岛科技大学
专　业: 有机化学
关键词: 核酸适体荧光定量PCR 滚环复制可卡因荧光
分类号: Q503
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

核酸适体(DNA aptamer)由于具有高亲和性及高特异性、分子量小、无免疫原性、配体广泛等优点,被越来越多的应用于目标分子(小分子或蛋白质)的识别和检测。而信号放大技术对不能进行直接扩增的低浓度待测分子的检测尤为重要,其中基于生物酶信号放大的荧光定量PCR 的学位论文">荧光定量PCR技术和滚环复制(RCA)技术常用的体外扩增方法。在本论文的研究中,将核酸适体识别与生物酶信号放大的荧光分析法相结合,提出了一类新颖的、灵敏的可卡因的检测方法。其主要内容如下:1基于核酸适体和荧光定量PCR技术检测可卡因新方法的研究本章中,基于核酸适体识别与荧光定量PCR生物酶信号放大技术实现了可卡因的实时定量检测。为了实现低背景和高信噪比,本章利用磁珠分离技术实现了PCR模板链的彻底分离及富集,在很大程度上提高了检测方法的灵敏性。而荧光定量PCR技术对模板链进行了2n倍的扩增,更进一步地提高了检测方法的灵敏性。结合以上两种技术,该检测方法可检测到9 fmol级的可卡因,并显示出良好的特异性。在最佳检测条件下,可卡因浓度在10-10 mol/L ~ 10-6 mol/L之间时,PCR循环闭值Ct值与可卡因的浓度之间存在线性关系,检测限为3×10-11 mol/L。2基于核酸适体和滚环复制技术检测可卡因新方法的研究本章中,基于核酸适体识别及滚环复制生物酶信号放大技术,构建出一种高灵敏检测可卡因的荧光分析方法。当有目标物质可卡因存在时,可卡因与核酸适体A链上的序列特异性结合,将核酸适体互补链B链从A链上替换下来,再以替换下来的B链为引物环化探针C链,从而通过滚环复制技术实现可卡因的定量检测,检测限为20 pmol。DNA链也可以固定在芯片表面进行滚环复制扩增,但是芯片上的滚环复制产物很难实现定量检测,因此在均相中利用此技术进行信号放大对实现分析物的高灵敏定量检测变得尤为重要。另外,本实验方法还利用纳米金颗粒比表面积大,能够结合成百上千条DNA链的性质,提高检测方法的灵敏度。总之,本实验方法具有很高的灵敏度和良好的特异性,为复杂生物环境下物质的检测提供新的思路和模式。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-12
第一章前言  12-32
  1 核酸适体研究进展  13-21
    1.1 核酸适体的定义  13
    1.2 核酸适体的来源及体外筛选  13-14
    1.3 核酸适体的特点  14-15
      1.3.1 靶物质的广泛性  14-15
      1.3.2 高亲和性和高特异性  15
      1.3.3 分子量小  15
      1.3.4 稳定性好，可重复性  15
      1.3.5 体外筛选、化学合成  15
    1.4 核酸适体的信号转换方式及应用  15-21
      1.4.1 基于电化学方法的信号转换原理  16-17
      1.4.2 基于荧光法的信号转换原理  17-21
        1.4.2.1 一般荧光法信号转换  17-18
        1.4.2.2 工具酶荧光法信号转换  18-21
  2 信号放大技术研究进展  21-31
    2.1 荧光定量PCR 信号放大技术  22-25
      2.1.1 荧光定量PCR 技术  22
      2.1.2 荧光定量PCR 技术的特点  22-23
      2.1.3 荧光定量PCR 技术的检测方法  23-24
        2.1.3.1 SYBR Green Ⅰ检测  23-24
        2.1.3.2 TaqMan 探针检测  24
      2.1.4 荧光定量PCR 技术的应用  24-25
    2.2 滚环复制信号放大技术  25-31
      2.2.1 滚环复制技术的原理  25
      2.2.2 滚环复制技术的特点  25-26
      2.2.3 滚环复制的检测方法  26-27
      2.2.4 滚环复制技术的应用  27-31
        2.2.4.1 在单核苷酸多态性（SNPs）检测分析中的应用  27-28
        2.2.4.2 在细胞原位检测分析中的应用  28-29
        2.2.4.3 在蛋白质芯片中的应用  29
        2.2.4.4 在纳米材料中的应用  29-31
  3 本课题的意义及研究内容  31-32
第二章基于核酸适体和荧光定量 PCR 技术检测可卡因新方法的研究  32-51
  1 前言  32-33
  2 实验部分  33-38
    2.1 试剂  33-34
    2.2 仪器  34
    2.3 B 链的设计  34
    2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳的制备  34-37
      2.4.1 基本原理  34-35
      2.4.2 凝胶浓度选择原则  35
      2.4.3 15%聚丙烯酰胺凝胶的制备  35-37
        2.4.3.1 安装电泳装置  35
        2.4.3.2 灌制凝胶  35-36
        2.4.3.3 上样与电泳  36
        2.4.3.4 检测PCR 产物  36-37
    2.5 实验方法  37-38
      2.5.1 金电极处理  37
      2.5.2 核酸适体的固定和杂交  37
      2.5.3 荧光定量PCR 技术检测可卡因  37-38
  3 结果与讨论  38-50
    3.1 实验原理  38-39
    3.2 检测方法的表征  39-44
      3.2.1 裸金电极与A 链的结合  40-41
      3.2.2 巯基封闭金电极结合位点  41-42
      3.2.3 A 链与B 链的杂交  42-43
      3.2.4 可卡因作用  43-44
    3.3 不同浓度B 链标准曲线的绘制  44-47
      3.3.1 B 链的紫外标准曲线  44-45
      3.3.2 B 链的荧光定量PCR 标准曲线  45-47
    3.4 可卡因的线性相关性及灵敏度的研究  47-49
    3.5 检测方法特异性的研究  49-50
  4 小结  50-51
第三章基于核酸适体和滚环复制技术检测可卡因新方法的研究  51-65
  1 前言  51-52
  2 实验部分  52-57
    2.1 试剂  52-53
    2.2 仪器  53
    2.3 DNA 链的设计  53-54
    2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳的制备  54
    2.5 实验方法  54-57
      2.5.1 Au 纳米粒子的制备  54-55
      2.5.2 Au 纳米粒子在磁珠上的修饰  55-56
      2.5.3 DNA 的固定和杂交  56
      2.5.4 可卡因作用  56
      2.5.5 信号放大及荧光检测  56-57
  3 结果与讨论  57-64
    3.1 实验原理  57-58
    3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳  58-59
    3.3 实验条件优化  59-61
      3.3.1 滚环复制作用时间优化  59
      3.3.2 分子信标杂交时间优化  59-60
      3.3.3 滚环复制反应条件的优化  60-61
    3.4 检测方法线性相关性及灵敏度的研究  61-63
    3.5 检测方法可重复性的研究  63-64
  4 小结  64-65
结论  65-66
参考文献  66-74
致谢  74-75
攻读学位期间发表的学术论文目录  75-76

基于核酸适体识别和生物酶信号放大检测可卡因的研究

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