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表达猪β-防御素-2成熟肽重组酵母工程菌的构建

作　者: 于宾宾
导　师: 何启盖
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪β-防御素 成熟肽 真核表达 活性实验
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


防御素(Defensins)是抗菌肽家族中一类重要的阳离子抗菌活性肽,广泛存在于动物和植物体内。防御素的抗菌谱十分广泛,可抑制或杀灭细菌、真菌、被膜病毒等多种病原微生物,特别是哺乳动物防御素还对支原体、衣原体、螺旋体和一些肿瘤细胞有杀伤作用。同时,防御素可以调节机体免疫系统并加速免疫系统的重建,在机体的抗感染过程中发挥重要作用。猪β-防御素2(pBD-2)是猪源抗菌肽中较为重要的一种,它主要来源于上皮组织,广泛分布于皮肤、胸腺、脾、肝脏、舌、呼吸道、胃肠道等器官的组织细胞中。猪β-防御素2成熟肽是一段由37个氨基酸残基组成的多肽,富含精氨酸等带正电的氨基酸,同时含有6个保守的半胱氨酸。这些带正电的氨基酸和由半胱氨酸形成的3对二硫键赋予了猪β-防御素2成熟肽独特的作用机理,使它活性稳定且不易产生耐药性。由于猪β-防御素2成熟肽分子内二硫键的存在对其活性有很大的影响,采用传统的原核表达系统不能对表达产物进行有效的翻译后的加工修饰,并且产物对宿主菌的毒性作用也会影响表达量的提高。相比之下,真核毕赤酵母表达系统有更好的翻译后加工修饰作用和表达量高等优点,近年来,毕赤酵母表达系统应用越来越广泛,人们利用该系统已成功的表达了多种防御素蛋白。由于猪β-防御素2成熟肽在机体内分泌的量很低,体外提取天然的防御素步骤繁琐、成本高、效率低,化学合成成本更高,不能满足对其结构和活性研究的需要,因此,利用基因工程的方法表达防御素将是一条捷径。本研究根据GeneBank已公布的猪β-防御素2成熟肽基因序列,参考酵母偏爱密码子,设计3段引物序列,利用PCR技术扩增得到β-防御素2成熟肽的DNA序列。在所得到的序列两端添加EcoRⅠ、NotⅠ酶切位点,将其重组于分泌型表达载体pPIC9K和已构建好的pPIC9k-GST重组载体,得到pPIC9K-pBD-2和pPIC9k-GST-pBD-2重组载体。选取阳性克隆鉴定正确后,用SalⅠ酶将重组载体线性化,用电转化的方法将其转化到毕赤酵母KM71细胞中,经特定培养基筛选后,PCR检测验证猪β-防御素2成熟肽基因片段正确整合到酵母基因组染色体上,从而得到稳定的猪β-防御素2成熟肽的毕赤酵母表达株。筛选得到的酵母阳性克隆经甲醇诱导,通过不断调节表达条件,实现了猪β-防御素2成熟肽在BMMY培养基里的表达。

全文目录


摘要  6-7
ABSTRACT  7-9
缩略语表(Abbreviation)  9-10
1 文献综述  10-24
  1.1 哺乳动物防御素研究进展  10-13
    1.1.1 哺乳动物防御素的分类与分布  10-11
    1.1.2 哺乳动物防御素的分子结构与进化特性  11-12
    1.1.3 哺乳动物防御素的作用机理和生物活性  12-13
  1.2 猪β-防御素(pBD)的研究进展  13-18
    1.2.1 猪β-防御素的分类  13-14
    1.2.2 猪β-防御素的结构特征  14-15
    1.2.3 猪β-防御素的抗菌活性与作用机理  15-16
    1.2.4 猪β-防御素克隆表达  16-17
    1.2.5 猪β-防御素发展前景  17-18
  1.3 毕赤酵母表达系统的研究进展  18-22
    1.3.1 表达宿主和载体  18-19
    1.3.2 外源基因的整合  19-20
    1.3.3 外源基因的表达  20
    1.3.4 毕赤酵母表达系统特点  20-21
    1.3.5 毕赤酵母表达系统高表达策略  21-22
  1.4 研究目的与意义  22-24
2 猪β-防御素-2成熟肽基因酵母工程菌的构建和表达  24-49
  2.1 材料  24-27
    2.1.1 质粒和菌株  24
    2.1.2 主要仪器设备  24
    2.1.3 主要试剂及配制  24-27
    2.1.4 主要应用的软件  27
    2.1.5 引物列表  27
  2.2 方法  27-39
    2.2.1 pBD-2成熟肽基因片段的设计  27-28
    2.2.2 pBD-2成熟肽基因的PCR扩增  28-29
    2.2.3 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备(CaCl_2法)  29
    2.2.4 pPIC9k-GST重组质粒的构建和鉴定  29-30
    2.2.5 pPIC9k-GST-pBD-2和pPIC9k-pBD-2重组载体的构建和鉴定  30-31
    2.2.6 含有pPIC9k-GST-pBD-2和pPIC9k-pBD-2质粒的阳性菌落的筛选  31-32
    2.2.7 毕赤酵母工程菌的构建  32-35
    2.2.8 pBD-2基因在毕赤酵母KM71中的表达  35
    2.2.9 Tricine-SDS-PAGE凝胶的制备及酵母表达上清液的蛋白电泳鉴定  35-37
    2.2.10 GST-pBD-2成熟肽的WesternBlot检测  37-38
    2.2.11 pBD-2表达上清的抑菌活性检测  38-39
  2.3 结果  39-46
    2.3.1 pBD-2基因的PCR扩增与双酶切  39
    2.3.2 GST基因的PCR扩增与双酶切  39
    2.3.3 pPIC9k载体的双酶切  39-40
    2.3.4 pPIC9k-GST-pBD-2重组载体的鉴定  40-41
    2.3.5 pPIC9k-pBD-2重组载体的鉴定  41-42
    2.3.6 重组毕赤酵母工程菌的筛选与鉴定  42-44
    2.3.7 重组酵母蛋白表达  44-45
    2.3.8 GST-pBD-2蛋白的WesternBlot验证  45
    2.3.9 pBD-2成熟肽的抑菌活性检测  45-46
  2.4 讨论  46-48
    2.4.1 pBD-2成熟肽基因的设计  46
    2.4.2 pPIC9k-GST-pBD-2和pPIC9k-pBD-2重组载体的构建  46-47
    2.4.3 毕赤酵母表达  47-48
    2.4.4 pBD-2活性检测  48
  2.5 结论  48-49
参考文献  49-55
致谢  55

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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