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抗体技术经历了多克隆抗体血清,单克隆抗体,基因工程抗体的发展阶段。利用基困工程技术可望实现将鼠抗体人源化或者生产人源抗体。基因工程抗体以其对人体无免疫原性,无污染源,特异性抗病毒疗效及连续规模生产可行性等优势逐渐成为预防和治疗疾病的一类可替代血源性免疫球蛋白的新型生物工程药。它能够在原核、真核、酵母,和重组病毒等不同的表达系统中进行抗体基因的表达生产。其中哺乳动物细胞能够帮助蛋白质正确的折叠,装配和转录后修饰,更接近人源蛋白,使得哺乳动物细胞成为生产应用于临床的重组蛋白制剂的主要体系,但不同的抗体基因在哺乳动物细胞内进行表达,其表达能力及水平有很大的不同,因此哺乳动物细胞高效表达体系被认为是制约抗体生产的瓶颈之一。影响抗体基因在哺乳动物细胞高效表达的因素主要包括抗体基因本身的序列,抗体基因在宿主染色体上的整合位点,抗体基因的拷贝数,转录翻译水平,宿主细胞的选择和修饰以及轻链,重链基因的均衡表达,细胞器特殊滞留信号,分子伴侣的突变等。已经阐明抗体基因重链可变区框架Ⅰ区氨基酸的组成对于抗体在原核表达系统中的分泌表达具有显著的影响,单个氨基酸的改变即可导致抗体分子分泌能力的丧失。为了探索重链可变区框架Ⅰ区对抗体在哺乳动物细胞中高效表达的影响,我们针对不同种类的基因工程抗体,对其框架Ⅰ区的氨基酸进行突变,研究该区氨基酸组成对抗体在哺乳动物细胞中分泌表达的影响。本研究主要利用定点突变技术,对由抗体工程技术获得的抗狂犬病病毒抗体,抗甲肝病毒抗体,抗禽流感病毒抗体,抗SARS冠状病毒核蛋白抗体,抗乙肝病毒抗体,抗汉坦病毒核蛋白抗体等人源重组抗体的重链可变区框架Ⅰ区的氨基酸进行定点突变,获得的突变克隆转染哺乳动物细胞293-T,研究突变对抗体分泌表达能力的影响。在进行研究之前,我们首先对抗体在哺乳动物细胞中的分泌能力及抗体基因的遗传信息学两个方面进行了评价与分析。在抗体分泌能力的评价中,我们将8株不同的抗病毒抗体基因转染哺乳动物细胞293-T进行瞬时表达。经检测,抗狂犬病病毒抗体合成后只存在于细胞内,不具有分泌能力,其它7株抗体基因合成的抗体除存在于细胞内之外,还可分泌表达。之后将上述8株抗体的基因序列与V-base数据库中的抗体基因序列进行分析比较,结果显示抗狂犬病病毒抗体重链可变区基因属于VH1家族,2株抗禽流感病毒抗体和2株抗汉坦病毒核蛋白抗体中各有一株的重链基因属于VH4家族,另外2株以及一株抗甲肝病毒抗体,一株抗SARS冠状病毒核蛋白抗体,一株抗乙肝病毒抗体的重链可变区基因均属于VH3家族。以上比较分析的结果是进行定点突变研究分泌表达的主要依据。为了探讨抗体重链可变区框架Ⅰ区这一因素对抗体分泌的影响,我们利用上述8株基因工程抗体,根据抗体基因与V-base数据库中的抗体基因比对分类的结果,运用定点突变技术,对这些抗体重链可变区框架Ⅰ区的氨基酸进行选择突变,由此获得FR-Ⅰ区不同的氨基酸组成。最终得到突变抗体基因12株,将12株抗体基因分别转染哺乳动物细胞293-T,进行瞬时表达。转染后的细胞用ELISA法分别对细胞上清及细胞裂解液中IgG抗体分子的表达情况进行检测,综合上述对原有8株抗体的检测结果可知,原有的8株抗体基因和突变后的12株抗体基因转染细胞后,在细胞裂解液中ELISA检测的抗体IgG滴度均可达到1:200以上,说明它们在细胞内都能合成完整的抗体。再对这些抗体的分泌情况进行分析,结果显示,抗狂犬病病毒抗体突变后获得的3株抗体中,有2株具有正常的分泌能力,1株不能分泌。原7株能够正常分泌的抗体经突变后获得的9株抗体中有1株分泌能力明显降低,3株不能分泌。综合以上结果,共有6株基因表达抗体的分泌能力发生了改变,其中2株得到了显著改善,4株分泌能力减弱。可见重链可变区框架Ⅰ区氨基酸的组成对抗体的分泌是有影响的。针对该因素对抗体分泌产生影响的机制,我们又运用双色免疫荧光细胞内共定位的方法,对4株分泌能力不同的抗狂犬病病毒抗体分别进行了细胞内抗体与内质网,高尔基体,溶酶体的共定位研究。研究发现,分泌能力正常的2株抗体能够形成与内质网、高尔基体的共定位,无分泌能力的2株抗体,不仅能形成与内质网、高尔基体的共定位,同时也能形成与溶酶体的共定位,即在内质网、高尔基体和溶酶体中均能检测到无分泌能力的抗体分子的存在,提示这2株不能分泌的抗体在细胞内合成后有一部分进入了降解途径。运用免疫荧光检测抗体的功能发现,无分泌能力的抗体,其中和抗原的能力也明显弱于正常分泌的抗体。由于抗体的功能与其结构紧密相关,重链可变区框架Ⅰ区氨基酸组成的改变有可能影响到整体分子的构象,使抗体分子在构象上出现微小缺陷,影响了抗体分子的折叠,从而使合成的抗体蛋白在通过Ouality Control机制的过程中受到了制约。本研究通过定点突变基因工程抗体重链可变区框架Ⅰ区的氨基酸,改变该区氨基酸的组成,对这一因素对抗体分泌的影响进行了探讨,这一研究对基因工程抗体在哺乳动物细胞中的高效表达提供了实验依据。
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