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脂肪间充质干细胞PD-L1基因沉默对大鼠肝移植急性排斥反应的影响

作　者: 杨青峰
导　师: 万赤丹
学　校: 华中科技大学
专　业: 外科学
关键词: 脂肪间充质干细胞慢病毒载体 PD-L1 肝移植急性排斥反应
分类号: R657.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的:构建PD-L1基因RNA干扰慢病毒表达载体,稳定转染脂肪间充质干细胞(ADSCs)实现PD-L1基因沉默;研究肝移植术前输注PD-L1基因沉默ADSCs对大鼠肝移植急性排斥反应的影响及机制。方法:设计针对PD-L1的shRNA序列,应用基因重组技术插入到pFU-GW-iRNA慢病毒表达载体,重组病毒质粒及其3种辅助包装原件载体质粒通过共转染293T细胞,包装产生的病毒感染ADSCs;利用两套管吻合技术行SD大鼠对Wistar大鼠异种原位肝移植模型,将受体Wistar大鼠随机分为4组,每组10只:对照组(A组),供体组(B组),第三方组(C组),第三方转染组(D组),行肝移植前7天,对照组输注1ml PBS,实验组分别输注1ml含有1×107个供体SD大鼠ADSCs、第三方SD大鼠ADSCs和第三方SD大鼠PD-L1基因RNA干扰ADSCs的PBS。术后7天处死大鼠,观察各组肝功能情况,IL-2和IL-10水平,肝脏病理变化,TUNEL检测细胞凋亡,Western blot检测Bcl-2和Bax蛋白的表达。结果:通过测序证实PD-L1干扰序列正确插入pFU-GW-iRNA载体,成功构建PD-L1基因RNAi慢病毒表达载体,病毒滴度为5×108TU/ml,在转染后48h,即可在荧光显微镜下见明亮的绿色荧光,最佳感染复数(MOI)为20;与A组相比,其它各组大鼠术后血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素和白介素2水平明显降低(P<0.05),D组高于C组;白介素10明显升高(P<0.05),D组低于C组;HE染色显示,A组大鼠肝组织呈急性重度排斥反应,B组、C组大鼠肝组织呈急性轻度排斥反应,D组大鼠肝组织呈急性中度排斥反应;TUNEL染色显示A组大鼠的肝脏组织切片上凋亡细胞大量存在,而B组和C组相对较少,D组可见较多凋亡细胞。Western blot结果显示:A组Bcl-2蛋白低表达,B组和C组表达较高,D组表达低于C组;A组Bax蛋白高表达,B组和C组表达较低,D组表达高于C组。结论:PD-L1基因RNAi慢病毒表达载体构建成功,ADSCs PD-L1基因敲减成功,术前输注PD-L1基因沉默的ADSCs对异基因大鼠肝脏移植引起的急性排斥反应抑制作用减弱,PD-1/PD-L1通路是ADSCs下调免疫反应的一个重要通路。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-10
引言  10-11
材料与方法  11-23
  1. 实验材料  11-14
    1.1 仪器和设备  11-12
    1.2 试剂  12-14
    1.3 动物  14
  2. 实验方法  14-23
    2.1 ADSCs 分离培养  14-15
    2.2 ADSCs 诱导分化  15-16
    2.3 ADSCs 流式鉴定  16
    2.4 慢病毒载体构建包装  16-17
    2.5 转染大鼠 ADSCs  17-19
    2.6 大鼠肝移植模型  19-20
    2.7 血清检测  20-21
    2.8 HE 染色  21-22
    2.9 TUNEL 检测细胞凋亡  22
    2.10 Western blot 检测 Bcl-2 和 Bax  22
    2.11 统计分析  22-23
结果  23-31
  3.1 ADSCs 的培养、诱导分化  23
  3.2 ADSCs 的流式鉴定  23-24
  3.3 慢病毒载体的构建、鉴定及包装  24-25
  3.4 慢病毒感染大鼠 ADSCs 的转染效率及 PD-L1 基因的表达  25-27
  3.5 血清检测  27
  3.6 HE 染色  27-28
  3.7 TUNEL  28-29
  3.8 Bcl-2 和 Bax 的表达  29-31
讨论  31-34
参考文献  34-37
综述  37-49
  参考文献  44-49
英文缩略词表  49-50
致谢  50-51

脂肪间充质干细胞PD-L1基因沉默对大鼠肝移植急性排斥反应的影响

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