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一种新型的Tet-off慢病毒调控系统的构建及其调控作用的研究

作　者: 杨春燕
导　师: 钱其军
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 慢病毒四环素 Tet-off 基因调控磷酸钙转染
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

四环素调控的真核表达系统是生物学研究中的一个重要的工具。四环素可调控表达系统利用大肠杆菌转座子Tnl0四环素抗性操纵子构建,其反式激活因子tTA和rtTA由四环素抑制蛋白的DNA结合区与VP16的转录激活区融合形成。利用反式激活因子tTA或rtTA的调控系统分别称为Tet-off系统或Tet-on系统。四环素表达调控系统包含四环素反应元件(Tetracycline-responsive element, TRE)和四环素调控转录激活因子(Tetracycline transcriptional activator,tTA)两部分。TRE和tTA两者可根据需要被重组到病毒或质粒上。目前研究者已成功地将四环素表达调控系统应用到腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、疱疹病毒及昆虫病毒等载体中,并且该表达调控系统已被广泛应用到体外培养的哺乳动物、植物、两栖动物、昆虫等动物的细胞中以及活体组织包括酵母菌、果蝇、植物、小鼠和大鼠中。2000年,Kafri等构建了基于慢病毒载体的Tet-off基因表达调控系统,这种基因表达系统能够有效控制目的基因表达,扩大了慢病毒载体的临床应用潜能,成为很有前景的基因治疗载体。当前大多研究者采用双质粒四环素表达调控系统调控外源基因的表达。然而,双质粒四环素表达调控系统的基因表达调控严格依赖于两个单载体同时感染一个细胞,因而限制其在体内实验中的效率。为了解决这个问题,我们构建了由慢病毒载体构成的单质粒四环素表达调控系统-pLV300(Tet-off)。该系统结合慢病毒的优点,如可感染非分裂细胞,介导的目的基因可整合入宿主细胞,实现靶基因的稳定长期表达以及免疫反应弱等,克服了传统研究中采用双质粒调控系统的操作不便且周期较长的缺陷。实验结果显示,该单质粒四环素调控的慢病毒载体体外可以高效地转移并且维持目的基因的表达,其表达调控效应高效、无毒且具有严密调控功能。该表达调控系统为慢病毒的临床应用奠定了一定基础。此外本实验优化PEI转染技术和磷酸钙转染技术,优化后的磷酸钙转染效率达85%以上,为后期慢病毒的包装奠定了良好的实验基础。

全文目录

摘要  7-8
ABSTRACT  8-12
第一章四环素可诱导慢病毒载体的研究进展  12-31
  1 前言  12-18
    1.1 慢病毒载体与基因治疗  12-13
    1.2 四环素调控的真核表达载体  13-16
    1.3 四环素可诱导慢病毒载体  16-18
  2 四环素调控的慢病毒载体Tet-off-eGFP，Tet-off-mKate 和Tet-off-hIL-24 的构建  18-28
    2.1 实验材料  18-21
      2.1.1 生化试剂  18
      2.1.2 培养基  18
      2.1.3 细胞培养液  18
      2.1.4 菌株和质粒  18-19
      2.1.5 细胞株系及培养条件  19
      2.1.6 引物合成  19-20
      2.1.7 主要仪器与设备  20-21
    2.2 实验方法  21-25
      2.2.1 质粒DNA 的制备  21-22
      2.2.2 从琼脂糖凝胶中回收DNA  22
      2.2.3 酶切、连接  22-23
      2.2.4 PCR 扩增  23
      2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化  23-25
    2.3 pLV300（可诱导慢病毒Tet-off）的构建  25-28
      2.3.1 pkc-TRE 载体的构建  25
      2.3.2 pLV300（可诱导慢病毒Tet-off）的构建  25
      2.3.3 pLV300-mKate，pLV300-eGFP 和pLV300-hIL-24 的构建  25-28
  3 实验结果与分析  28-30
    3.1 质粒pkc-TRE 鉴定  28-29
    3.2 pLV300（可诱导慢病毒Tet-off）的鉴定  29
    3.3 pLV300-mKate、pLV300-eGFP、pLV300-hIL-24 的鉴定  29-30
  4 结论  30-31
第二章慢病毒包装条件优化及四环素调控的慢病毒载体pLV300 调控系统“开”“关”验证  31-53
  1 前言  31-33
  2 实验方法  33-39
    2.1 慢病毒包装条件优化  33-35
      2.1.1 PEI 转染法  33
      2.1.2 PEI 细胞毒性检测（MTT）  33
      2.1.3 PEI 转染法优化策略  33-34
      2.1.4 磷酸钙转染法  34
      2.1.5 磷酸钙转染法条件优化  34
      2.1.6 慢病毒包装、纯化及浓缩及滴度测定  34-35
    2.2 四环素调控的慢病毒LV300 功能鉴定  35-39
      2.2.1 四环素（Tetracycline,Tet）细胞毒性检测  35
      2.2.2 四环素调控pLV300-mKate 红色荧光蛋白mKate 表达的“开”“关”效应  35
      2.2.3 pLV300-mKate 转染HEK 293T/17 细胞研究不同四环素浓度对红色荧光蛋白mKate 的调控效应以及四环素不同作用时间对红色荧光蛋白表达的影响  35
      2.2.4 pLV300-hIL-24 转染 HEK 293T/17细胞，酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked Immuno-sorbent Assay ,ELISA）检测hIL-24 表达  35-37
      2.2.5 研究四环素调控的慢病毒LV300-eGFP 和LV300-mKate 调控功能以及不同浓度四环素对红色荧光蛋白mKate 的调控效应  37-39
  3 实验结果与分析  39-50
    3.1 慢病毒包装条件的优化  39-43
      3.1.1 PEI 的细胞毒性  39-40
      3.1.2 PEI 转染法优化  40
      3.1.3 磷酸钙转染法条件优化  40-43
        3.1.3.1 磷酸钙转染法条件优化参数一  40-41
        3.1.3.2 磷酸钙转染法条件优化参数二  41-42
        3.1.3.3 磷酸钙转染法条件优化参数三  42-43
    3.2 四环素调控的慢病毒载体调控效应的验证  43-50
      3.2.1 四环素毒性检测  43-44
      3.2.2 四环素调控pLV300-mKate 红色荧光蛋白mKate 表达的“开”“关”效应  44-45
      3.2.3 四环素调控的慢病毒pLV300-mKate 调控效应具有四环素浓度依赖性  45-46
      3.2.4 pLV300-hIL-24 转染HEK 293T/17 细胞，ELISA 检测不同四环素浓度的hIL-24表达差异  46-47
      3.2.5 单质粒四环素调控的慢病毒LV300-mKate 载体是一个有效的“Tet-off”调控系统  47-50
  4 讨论  50-52
  5 结论  52-53
参考文献  53-57
在线期间发表论文  57-58
致谢  58

一种新型的Tet-off慢病毒调控系统的构建及其调控作用的研究

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