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研究背景臭氧(Ozone, O3)具有强氧化性与不稳定性,在常温常压空气中易还原为氧气(半衰期45分钟)。臭氧可溶于水,在常温常压下臭氧在水中的溶解度比氧高约13倍,比空气高25倍。但臭氧在水中的分解速度比空气中快的多。如水中臭氧浓度为6.25×10-5 mol/L(3mg/l)时,其半衰期为5-30min,但在纯水中分解速度较慢,如在蒸馏水或自来水中的半衰期大约是20min(20℃),然而在二次蒸馏水中,经过85min后臭氧分解只有10%,若水温接近0℃时,臭氧会变得更加稳定。医用臭氧(Medical ozone, O2-O3)是利用医用纯氧制备的臭氧与纯氧的混合气体,具有较强的氧化作用,能通过氧化还原作用迅速杀灭细菌,为广谱有效的强杀菌剂。随着对医用臭氧的生物药学特性认识的深入研究,臭氧在医疗界中被广泛应用,在欧洲等地医用臭氧广泛用于治疗糖尿病足、创伤及皮肤溃疡的愈合、脑中风、溃疡性结肠炎、关节炎、椎间盘突出症等疾病,其临床疗效得到了充分肯定。臭氧溶于水后形成的臭氧水具有更强的消毒杀菌功能和分解催化作用,能把有机物、重金属分解或转化为对人体无害的物质。针对臭氧水这一特性,国内外学者在临床中大量应用臭氧消毒水,对感染性创面清创,口腔含漱,阴道冲洗消毒等方面取得了良好的效果,而且臭氧水制备设备体积小,制备简单迅速,在冰箱中保存可使用3-4天,相对于传统的消毒剂有明显的优势。临床应用结果表明臭氧治疗具有显著的优越性,但为何迟迟未能真正推广呢?其最根本的原因就是其基础研究远远落后于临床实践,许多作用及机制尚未明了,限制了其临床治疗领域的扩展；尤其是目前尚缺乏有关臭氧治疗安全性以及使用浓度的系统的基础研究,成为其发展的瓶颈。因此,医用臭氧安全性及应用浓度范围的相关研究研究显得尤为重要。目前关于臭氧疗法安全性的研究集中在臭氧对血液及血细胞特别是红细胞的影响方面。臭氧有强烈的氧化作用,接触一定浓度、一定的持续时间会造成机体的损害。虽然血浆中有缓冲系统以及一系列的抗氧化剂存在(如维生素C、尿酸、巯基蛋白、糖蛋白等),造成臭氧的作用被中和、活性迅速降低,但仍有部分的臭氧在血浆中会生成活性氧(ROS),在体外血液实验中,ROS可以触发若干生物化学通路,生成的ROS在0.5-1.0分钟内被血浆中的抗氧化系统中和；在接触并溶解在血浆中时,臭氧迅速和抗氧化剂及多不饱和脂肪酸发生反应,级联生成一系列复合物,如过氧化氢、脂质过氧化产物等(其中作用较明显的4—羟壬烯醛能够激活血液、内皮细胞和实质细胞的某些功能,从而发挥对各种疾病的生理功能调节及治疗的效应)。Bocci等的研究表明,医用臭氧浓度小于80μg／ml,血液及红细胞中的缓冲系统、抗氧化系统可以抵抗臭氧对组织、细胞的损伤作用,从而发挥臭氧的治疗作用；当臭氧浓度大于80μtg／ml,则易引起组织细胞的损伤,随着臭氧浓度的增加,损伤作用更加明显。但是以往针对臭氧的研究主要集中在臭氧气体的抗炎、镇痛、免疫调节,臭氧水的研究较少,而且主要集中在临床效果这一方面。因此,有必要更进一步探讨,与臭氧气体相比较,臭氧水的浓度不同,其作用效果是否不同?不同浓度的臭氧水作用于机体,机体的局部组织发生了何种变化,是何种机制导致了这种变化?这些问题是临床臭氧治疗医师共同关注的问题,在一定程度上影响患者对臭氧治疗的接受程度,成为医用臭氧治疗推广应用的一个阻碍。但目前国内外尚未见相关报道。研究目的1.不同浓度臭氧水对感染性创面的抗炎与修复作用的效果；2.臭氧水治疗感染性创面后,对内源性生长因子含量的影响,探讨臭氧水抗炎修复作用的机制。研究方法1.臭氧水对感染性创面抗炎修复作用部分将50只vista大鼠随机分成5组,洗必泰治疗组、低、中、高浓度臭氧水治疗组、对照组(不做特殊处理)各10只。首先在大鼠背部造成实验性感染性伤口,感染成功后48 h进行治疗,每天1次,9天为1疗程。在治疗前、治疗后3、6、9 d后分别对感染伤口的变化进行观察,抽取鼠尾静脉血检查白细胞计数,切取皮肤、肌肉组织标本进行光镜病理分析。2.臭氧水对感染性创面修复作用与内源性细胞因子含量变化的关系部分在第一部分的实验基础上,同时在治疗前、治疗后3、6、9 d后,分别切取创面的皮肤、肌肉组织标本,用elisa法分别检测其细胞因子(TNF-α、EGF)的含量,并探讨这两种细胞因子含量变化与臭氧水对创面修复作用的关系3.统计学分析：所得数据用SPSS13.0软件行统计学处理,对各组的白细胞总数、EGF含量、TNF-α含量,分别在感染前、后以及治疗后各阶段比较采用General Linear Model中的repeated measures进行分析,检验水准为a=0.05,-0.05表示差异有统计学意义或有显著性差异；在治疗各个阶段,治疗组与对照组比较以及洗必泰组与臭氧水治疗组比较,以及治疗3、6、9d后,不同浓度臭氧水治疗组间两两比较,采用Compare Means中的one-wayanova进行分析(文件需要Splitfile),检验水准为a=0.05,P≤0.05表示差异有统计学意义或有显著性差异。研究结果1.人工感染伤口所见：治疗后比较,臭氧水治疗组疗效远优于对照组以及洗必泰组,其中10mg／L与20mg／L臭氧水组疗效又优于5mg／L组。2.白细胞总数变化：治疗3、6、9d后,10mg／L与20mg／L组白细胞总数无显著性差异(P>0.05),而前两者与5mg／L组在治疗后3、6d后有显著性差异(P<0.05)。治疗后9d,三种浓度的臭氧水治疗组白细胞的总数差异不显著。3.光镜所见：治疗3d后,臭氧水治疗组炎症病理减轻,可见新生表皮细胞,以10mg／L组与20mg／L组明显；对照组炎症改变加重,出现肌纤维坏死。治疗6d后,洗必泰组炎症减轻不明显；臭氧水治疗组炎症病理进一步减轻,其中10mg／L组与20mg／L组上皮结构修复完整；对照组皮肤、肌肉坏死表现进一步加重。治疗后9d,洗必泰组炎症表现减轻,开始出现部分表皮细胞连接；臭氧水治疗组只有轻微的炎症表现,无渗出,10mg／L组与20mg／L组大部分恢复正常皮肤,肌纤维肉芽组织大量生长；对照组出现慢性炎症的表现。4.EGF含量变化：在治疗各个阶段,治疗组与对照组比较以及洗必泰组与臭氧水治疗组比较均有显著性的差异(P<0.05),治疗3、6、9d后,10mg／L与20mg／L组无显著性差异(P>0.05),而前两者在治疗后3、6d后,EGF含量高于5mg／L组。而在治疗后9d,三种浓度的臭氧水治疗组EGF含量差异不显著。5.TNF-α含量变化：在治疗各个阶段,治疗组与对照组比较以及洗必泰组与臭氧水治疗组比较均有显著性的差异,治疗3、6、9d后,10mg／L与20mg／L组无显著性差异,而前两者与5mg／L组在治疗后3、6d后有显著性差异,在治疗后第9d差异不显著,5mg／L组TNF-α含量高于前两者。结论1.中、高浓度臭氧水的抗炎消毒效果优于低浓度组,而中与高浓度组的效果没有明显差异,提示在临床应用中,10-20mg／L的臭氧水已足够控制甚至消灭创面感染。2.EGF与大鼠创面的抗炎修复结局成正相关性,臭氧水治疗能促进创面组织中的EGF含量的升高,而且与其浓度有关,其中以10mg／L与20mg／L浓度组最佳,EGF含量在治疗过程中逐步增加。3.臭氧水治疗对创面中TNF-α含量影响异于EGF,臭氧水治疗组中TNF-α含量普遍低于洗必泰组以及对照组,其中10 mg／L与20 mg／L浓度臭氧水治疗组中的TNF-α含量最低。臭氧水在治疗感染性创面的过程中降低了TNF-α含量,从而抑制了NF-KB系统的活性,达到抗炎修复组织的目的。
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