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CD11a（ITGAL）、CD70（TNFSF7）基因甲基化定量芯片的构建

作　者: 张秀娟
导　师: 陆前进
学　校: 中南大学
专　业: 皮肤病与性病学
关键词: CD70 CD11a DNA甲基化系统性红斑狼疮 T细胞基因芯片
分类号: R593.241
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的：建立一种简便、快速、精确的甲基化定量芯片,检测CD11a (ITGAL)和CD70 (TNFSF7)基因启动子区甲基化水平。方法：1.亚硫酸氢钠基因组测序：DNA的亚硫酸氢钠处理,然后,巢式PCR扩增目的基因并纯化回收,最后进行克隆并测序。2.DNA芯片的制备：包括探针的设计、点样及固定。3.标准曲线的建立：将甲基化阳性与阴性标准品的PCR产物按不同比例(1：0,0.75：0.25,0.5：0.5,0.25：0.75,0：1)混合,与已制备好的芯片杂交,定量荧光强度。甲基化探针荧光强度为M,非甲基化探针荧光强度为U。以M/(M+U)为纵坐标,甲基化阳性产物在总产物中的百分比为横坐标。每组探针分别对应5个散点,进行一元线性回归分析,得到一条呈线性关系的荧光强度标准曲线。4.芯片方法的验证：每个基因选取一个病人和一个健康对照者同时用芯片和亚硫酸氢钠基因组测序的方法计算其甲基化水平来验证芯片的效度。5.芯片方法在临床样本检测中的应用：收集20例SLE患者及20例健康对照者的外周血(在知情同意的前提下),提取PBMC,并用磁珠分选出CD4+T细胞,提取DNA,经亚硫酸氢钠转化处理后,进行目的基因PCR扩增,与所制备的芯片进行杂交,扫描,计算其甲基化水平。结果：1.芯片荧光强度和甲基化水平呈线性相关。CD70：y=0.925x+0.017(R2=0.9912);CD11a：y=0.933x-0.014(R2=0.9832)。2.同一样本的芯片结果与甲基化检测的金标准亚硫酸氢钠测序结果相似。甲基化芯片：SLE及健康对照者CD11a、CD70基因启动子区甲基化水平(CD11a：0.3028(SLE)；0.6172(Control);CD70:0.2847(SLE); 0.6718(Control))亚硫酸氢钠测序(CD11a:0.2857(SLE);0.5750(Control); CD70:0.2955(SLE); 0.6212(Control))。3.20例SLE患者与20例健康对照者的甲基化芯片检测结果显示,与健康对照者比较,SLE患者CD4+T细胞CD11a、CD70基因启动子区甲基化水平明显低下,其差异具有显著性(p<0.05)。结论：成功建立了CD70,CD11a基因启动子区5个CpG位点的甲基化定量检测芯片。为SLE的病情判断及预后评估提供一种新的简便、快速、精确的检测工具。

全文目录

中文摘要  5-7
英文摘要  7-11
缩略词  11-12
第一章前言  12-14
第二章材料与方法  14-28
  2.1 研究对象  14
  2.2 仪器设备与试剂  14-15
    2.2.1 主要仪器设备  14
    2.2.2 主要试剂及耗材  14-15
  2.3 DNA芯片的制备  15-17
    2.3.1 芯片杂交原理  15-16
    2.3.2 探针的设计  16
    2.3.3 探针的点样  16
    2.3.4 探针的固定  16-17
  2.4 制备甲基化阴性和甲基化阳性标准品  17-24
    2.4.1 亚硫酸氢钠测序  17-24
      2.4.1.1 DNA的亚硫酸氢钠处理  17-18
      2.4.1.2 巢式PCR  18-20
      2.4.1.3 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳  20-21
      2.4.1.4 PCR产物的纯化回收  21
      2.4.1.5 大肠杆菌(DH5α)感受态细胞的制备  21-22
      2.4.1.6 连接  22
      2.4.1.7 转化  22-23
      2.4.1.8 重组质粒的鉴定及提取  23
      2.4.1.9 质粒的鉴定与测序  23-24
    2.4.2 挑选甲基化阴性和甲基化阳性质控品  24
  2.5 芯片杂交反应  24-27
    2.5.1 外周血单核细胞分离  24-25
    2.5.2 磁珠分离CD4+T细胞  25
    2.5.3 DNA抽提  25-26
    2.5.4 对抽提出的DNA进行亚硫酸氢钠转化处理  26
    2.5.5 巢式PCR  26
    2.5.6 芯片杂交  26-27
    2.5.7 扫描检测  27
    2.5.8 计算样本甲基化程度  27
  2.6 标准曲线的建立  27
  2.7 芯片方法的验证  27
  2.8 芯片方法检测临床样本  27
  2.9 统计学方法  27-28
第三章结果  28-34
  3.1 标准曲线的建立  28-30
  3.2 芯片验证结果  30-31
  3.3 芯片方法在临床样本中的应用  31-34
第四章讨论  34-36
第五章结论  36-37
参考文献  37-40
综述  40-52
致谢  52-53
攻读学位期间主要的研究成果  53

CD11a（ITGAL）、CD70（TNFSF7）基因甲基化定量芯片的构建

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