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DNA甲基化对人单核细胞FcεRIγ亚基基因表达的调节及其在特应性皮炎发病中的作用

作　者: 王萍
导　师: 文海泉
学　校: 中南大学
专　业: 皮肤病与性病学
关键词: 5-azaC FcεRI FcεRIγ 甲基化单核细胞特应性皮炎
分类号: R758.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

特应性皮炎是一种遗传、免疫和环境等因素相互作用的炎症性皮肤病,其确切的发病机制尚未完全明了,现有研究证实树突状细胞和单核细胞表面IgE高亲和力受体(FcεRI)异常表达与特应性皮炎发病密切相关,而FcεRIγ亚基的表达在树突状细胞FcεRI表达中起关键作用。研究发现FcεRIγ亚基基因转录启动子中存在两处Alu重复序列,而Alu序列是DNA甲基化的高发区,那么DNA甲基化是否参与FcεRIγ亚基基因转录表达的调控?病理性DNA低甲基化对FcεRIγ亚基基因的调控是否参与特应性皮炎的发病?本课题以DNA甲基化对FcεRIγ亚基基因转录表达的调控作用为着眼点,研究树突状细胞的前提细胞即单核细胞通过DNA甲基化转移酶抑制剂处理后FcεRIγ亚基基因的表达,特应性皮炎患者和正常人单核细胞FcεRIγ亚基基因表达及DNA甲基化状态的差异；从而探讨病理性DNA低甲基化对人单核细胞FcεRIγ亚基表达的调控在特应性皮炎发病中的作用。目的研究DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮杂胞苷(5-azaC)干预对正常单核细胞FcεRIγ亚基基因表达的影响,从而探讨DNA甲基化对单核细胞FcεRIγ亚基基因表达的调控。方法密度梯度离心分离3名健康志愿者的外周血单个核细胞,磁珠分选单核细胞,脂多糖(LPS)刺激培养,分别用或不用DNA甲基化转移酶抑制剂(5-azaC)处理3天；而后收集细胞分别作流式细胞检测,提取全基因组DNA、mRNA及蛋白；然后用亚硫酸盐氢钠基因组测序法检测药物处理与未处理单核细胞FcεRIγ亚基启动子DNA甲基化调控序列DNA甲基化水平；western-bolt法、实时定量聚合酶链反应(real-time RT-PCR)分别检测FcεRIγ亚基的蛋白与mRNA的表达水平。结果与未处理组相比,(1)5-azaC处理组单核细胞FcεRIγ亚基mRNA水平明显升高(P=0.008)；(2)5-azaC处理组单核细胞FcεRIγ亚基蛋白水平明显升高(P=0.007)；(3)5-azaC处理组单核细胞表面FcεRI表达水平明显升高(细胞百分率P=0.001,荧光平均强度P=0.005)；(4)5-azaC处理组单核细胞FcεRIγ亚基基因调控序列DNA甲基化水平明显降低(P=0.003)；结论单核细胞FcεRIγ亚基基因表达受DNA甲基化调控,并影响单核细胞FcεRI表面的表达。目的研究AD患者外周血单核细胞是否存在FcεRIγ亚基及FcεRI表达异常,并是否受DNA甲基化调控。方法密度梯度离心分离10例AD患者和10例正常人的外周血单个核细胞,磁珠分选单核细胞,用流式细胞仪检测FcεRI蛋白在单核细胞表面的表达水平；实时定量聚合酶链反应(real-time RT-PCR)检测FcεRIγ亚基的mRNA表达水平；western-blot检测FcεRIγ亚基的蛋白表达水平；亚硫酸氢钠测序检测FcεRIγ亚基启动子DNA甲基化调控序列的甲基化状态。结果与正常对照组相比,(1)AD组单核细胞FcεRIγ亚基mRNA水平明显升高(P=0.01)；(2)AD组单核细胞FcεRIγ亚基蛋白水平明显升高(P=0.000)；(3)AD组单核细胞表面FcεRI表达水平明显升高(细胞百分率P=0.045,荧光平均强度P=0.000)；(4)AD组单核细胞FcεRIγ亚基基因调控序列DNA甲基化水平明显降低(P=0.001)；(5)我们还发现AD患者FcεRIγ亚基启动子DNA甲基化水平与FcεRIγ亚基蛋白表达呈负相关性(R=-0.711,P=0.021)。结论AD患者单核细胞FcεRIγ亚基基因调节序列甲基化水平低下,导致FcεRIγ亚基与FcεRI在细胞表面过度表达,从而参与疾病的发病过程。

全文目录

中文摘要  5-8
英文摘要  8-11
缩略词表  11-15
论文正文  15-61
  前言  15-17
  第一部分 FcεRIγ亚基基因DNA甲基化调控的研究  17-44
    第一章前言  17
    第二章材料与方法  17-36
      2.1 研究对象  17
      2.2 主要仪器设备及试剂  17-22
      2.3 实验方法  22-36
    第三章结果  36-42
      3.1 药物处理前后单核细胞FcεRIγ亚基的mRNA表达水平  36-37
      3.2 药物处理前后单核细胞FcεRIγ亚基的蛋白表达水平  37-38
      3.3 药物处理前后单核细胞表面IgE高亲和力受体(FcεRI)的表达水平  38-39
      3.4 药物处理前后FcεRIγ亚基启动子DNA甲基化调控序列DNA甲基化水平  39-42
    第四章讨论  42-43
    第五章结论  43-44
  第二部分特应性皮炎患者与正常对照者单核细胞FcεRIγ亚基表达及调控序列甲基化状态的研究  44-58
    第一章前言  44
    第二章材料与方法  44-49
      2.1 研究对象  44-45
      2.2 主要仪器设备及试剂  45-47
      2.3 实验方法  47-49
    第三章结果  49-55
      3.1 AD患者外周血单核细胞FcεRIγ亚基的mRNA表达水平  49-50
      3.2 AD患者外周血单核细胞FcεRIγ亚基的蛋白表达水平  50-51
      3.3 AD患者外周血单核细胞表面IgE高亲和力受体(FcεRI)的表达水平  51-53
      3.4 AD患者外周血FcεRIγ亚基启动子DNA甲基化调控序列DNA甲基化水平  53-54
      3.5 FcεRIγ亚基基因启动子调节序列甲基化水平与FcεRIγ亚基蛋白表达水平的相关性分析  54-55
    第四章讨论  55-57
    第五章结论  57-58
  参考文献  58-61
综述  61-69
致谢  69-70
攻读学位期间主要的研究成果  70

DNA甲基化对人单核细胞FcεRIγ亚基基因表达的调节及其在特应性皮炎发病中的作用

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