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咖啡碱对茶树主要叶部病原真菌的抑制作用

作　者: 张华艳
导　师: 张正竹
学　校: 安徽农业大学
专　业: 茶学
关键词: 茶咖啡碱病原真菌抑菌作用咖啡碱合成酶基因实时定量PCR
分类号: S435.711
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

咖啡碱是茶叶中嘌呤碱的主体成份,是茶树叶片中的特征成分之一。到目前为止人们已经对咖啡碱的生物学活性、生物合成和代谢途径等方面进行了大量的研究,但是在咖啡碱抑制植物病原菌活性方面的报道却很少。本文主要研究了咖啡碱对茶树叶部病原真菌的抑制作用,探讨了咖啡碱和茶树抗病性的关系。研究了咖啡碱和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对茶树主要叶部病原真菌生长的影响,结果表明咖啡碱对茶树4种主要叶部病原真菌(茶炭疽病原菌、茶云纹叶枯病原菌、茶轮斑病原菌、茶赤叶斑病原菌)具有显著的抑制作用,当培养基中咖啡碱浓度在1~10 mg·mL–1时,抑制率为33.0~100.0%,对4种病原真菌的有效中浓度EC50分别为0.917、1.86、0.937、1.889 mg·mL–1,而EGCG在试验设计浓度下没有明显的抑制作用。为了筛选茶叶中的主要抑菌物质,将咖啡碱、茶粉、茶叶水提物、脱咖啡碱茶叶水提物和茶渣分别添加到PDA培养基中,在培养基上分别接种3种茶树叶部病原真菌(茶轮斑病原菌、茶炭疽病原菌、茶褐色叶斑病原菌),分析不同添加物的抑菌作用,结果表明,5种处理抑制率为-32%~70%,且5种处理对3种病原真菌抑制作用趋向一致,抑制作用大小顺序为:咖啡碱>茶粉>茶叶水提物>脱咖啡碱茶叶水提物>茶渣。结果提示:咖啡碱是茶树叶部病原真菌的一种抗菌物质,儿茶素对茶树主要叶部病原真菌没有抑制作用,茶树叶片中咖啡碱的含量高低可作为评价茶树品种抗病性的指标之一。比较了不同茶树品种、不同叶位茶鲜叶中咖啡碱含量,探讨了咖啡碱含量与茶树对叶部病原真菌的抑制作用的关系。咖啡碱在嫩叶中含量高,在成熟叶中含量低,这和茶树叶部病害主要发生在成叶的现象相吻合。为了进一步探讨咖啡碱抑制病原菌的机理,采用实时荧光定量PCR方法,从分子水平上检测了控制咖啡碱合成的三个关键酶(咖啡碱合成酶、腺苷甲硫氨酸合成酶、次黄嘌呤核苷酸脱氢酶)的基因表达量变化规律,结果表明这三种酶在同等叶位的正常成熟叶和染病成熟叶中的表达量没有明显差异,这和咖啡碱在同等叶位的正常成熟叶和染病成熟叶中的含量相近现象相呼应。本文没有找出咖啡碱合成关键酶基因在正常茶树叶片和感病茶树叶片中的表达差异,可能与选择的试验材料(成熟叶片)中咖啡碱合成关键酶基因表达量过低有关。

全文目录

中文摘要  3-4
Abstract  4-9
1 文献综述  9-16
  1.1 咖啡碱概述  9-10
  1.2 咖啡碱生物学活性及作用机理  10-12
    1.2.1 咖啡碱对中枢神经系统的作用  10-11
    1.2.2 长期摄入咖啡碱对大脑受体密度的影响  11
    1.2.3 咖啡碱对行为的影响  11-12
  1.3 咖啡碱的生物合成  12-14
  1.4 茶树主要叶部病害种类及危害  14-15
    1.4.1 茶云纹叶枯病  14
    1.4.2 茶轮斑病  14
    1.4.3 茶炭疽病  14-15
    1.4.4 茶赤叶斑病  15
  1.5 咖啡碱抑菌性的研究进展  15-16
2 引言  16-17
  2.1 课题立题及实验依据  16
  2.2 主要研究内容  16
  2.3 课题来源  16-17
3 材料与方法  17-26
  3.1 材料与试剂  17-18
    3.1.1 材料  17
    3.1.2 主要仪器  17
    3.1.3 试剂  17-18
  3.2 培养基的配制  18
  3.3 茶树病原菌的分离与培养  18
    3.3.1 准备工作  18
    3.3.2 分离与培养  18
  3.4 咖啡碱和EGCG 对病原菌的抑制作用测定  18-19
  3.5 茶叶中的主要抑菌物质的筛选试验  19
  3.6 数据分析方法  19
  3.7 茶树感病处理与咖啡碱含量检测方法  19-20
  3.8 不同处理条件下茶叶中咖啡碱含量的测定  20
    3.8.1 不同叶位咖啡碱含量的测定  20
    3.8.2 正常叶和染病叶咖啡碱含量的测定  20
  3.9 茶鲜叶中RNA 的提取、检测与cDNA 链的合成  20-22
    3.9.1 总RNA 的提取与检测：参考文献的方法  20-21
    3.9.2 RNA 的检测  21-22
  3.10 特异条带的PCR 扩增反应  22-23
  3.11 PCR 反应产物的纯化  23
  3.12 PCR 反应产物与T-载体连接  23-24
  3.13 制备感受态细胞，参考文献  24
  3.14 转化  24
  3.15 菌落PCR  24
  3.16 Real Time PCR  24-26
4 结果与分析  26-33
  4.1 咖啡碱对4 种茶树主要叶部病原真菌生长的抑制作用  26-27
  4.2 EGCG 对4 种茶树主要叶部病原真菌生长的抑制作用  27-28
  4.3 用3 种茶树病原真菌筛选茶叶中的抑菌成分  28-29
  4.4 不同品种茶树抗病性和叶片中咖啡碱含量的关系  29-30
  4.5 茶树不同叶位咖啡碱含量的测定  30-31
  4.6 正常叶和感病叶中咖啡碱含量的测定  31
  4.7 TCS1、sAMS 和TIDH 在正常和感病茶树叶片中差异表达  31-33
5 讨论  33-35
  5.1 咖啡碱对4 种茶树主要叶部病原真菌生长的抑制作用  33
  5.2 儿茶素EGCG 对4 种茶树主要叶部病原真菌生长的抑制作用  33
  5.3 用3 种茶树病原真菌筛选茶叶中的抑菌成分  33-34
  5.4 不同茶树品种抗病性和咖啡碱含量的关系  34
  5.5 茶树不同叶位叶片中咖啡碱含量的测定  34
  5.6 TCS1、sAMS 和TIDH 基因在正常和染病茶树叶片中差异表达  34-35
6 结论  35-36
参考文献  36-43
致谢  43-44
作者简介  44
研究生期间发表论文  44

咖啡碱对茶树主要叶部病原真菌的抑制作用

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