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苹果果胶低聚糖的酶法制备、分离及其抑菌活性研究

作　者: 王江浪
导　师: 马惠玲
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 野生动植物保护与利用
关键词: 果胶低聚糖果胶内切酶响应面法抑菌活性二价金属离子
分类号: S661.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

随着我国苹果及苹果浓缩汁产量的增加,作为生产苹果汁副产物的苹果渣利用便成为一个极具开发潜力的课题。我省作为苹果大省,每年有大量的苹果渣亟待处理。作为一种高附加值产品,果胶低聚糖是开发利用苹果渣的有效途径之一,然而,其深加工工艺在国内却鲜有报道。本研究以苹果渣果胶和根酶果胶酶为试材,通过单因素和响应面试验,以低聚糖的产率和抑菌活性为目标,优化了苹果果胶酶法制备果胶低聚糖的工艺条件,旨在为苹果果胶低聚糖未来的深入研究和产业化开发提供理论和技术依据。研究结果如下:(1)pH、酶用量、反应温度、底物浓度和反应时间5因素均对该果胶酶催化苹果果胶降解的反应效率有影响,在温度和底物浓度确定的情况下,另外3个因素水平共同决定着反应产物的生成量,其作用强弱顺序为:pH>反应时间>酶用量,即控制反应的最佳pH对发挥高酶活性尤为重要。(2)本研究通过响应面法优化反应工艺参数得出根霉果胶酶(Rhizopus Sp.Pectinase,EC 232-883-6)对多聚半乳糖醛酸的转化率达63.54%,相当于供试果胶样品(多聚半乳糖醛酸含量84.3%)对低聚糖产率53.56%。(3)苹果果胶低聚糖对两种肠道有害微生物——大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用,而对供试的三种霉菌——米曲霉、青霉和根霉的抑制作用则较为微弱,说明该果胶低聚糖对喜碱性的细菌类抑制作用较之喜微酸性的霉菌类强。(4)在最佳工艺条件下,酶解产物不仅得率最高而且对两种肠道有害微生物——大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长的抑制作用也最强。通过响应面优化获取高产工艺与得到高活性产品之间完全一致,可以方便地选取得率作为工艺筛选的指标。(5)反应体系中添加Ca2+可促进果胶酶催化活性,浓度为7.0μmol?mL-1时促进作用最强,提高酶比活达60.92%,使多聚半乳糖醛酸的低聚化率达到94.46%,是一条适用于规模化生产的极有潜力的工艺路线。Fe2+在低浓度时对酶活性有一定的促进作用,高浓度则表现为抑制作用。(6)苹果果胶低聚糖的分离纯化以凝胶过滤色谱效果最佳,本研究采用日本TOYOPEARL HW-40C型凝胶柱填料对酶解产物进行分离,目前初步得到5个峰。分离的柱色谱条件为:50μmol?mL-1 NaCl溶液洗脱,流速0.2mL?min-1,每1.0mL洗脱液收集1管,以平板抑菌法跟踪检测其抑菌活性,结果表明,组分2的抑菌活性最强。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
第一章文献综述  9-23
  1.1 研究目的  9-10
    1.1.1 研究目的及意义  9
    1.1.2 研究内容及目标  9-10
  1.2 国内外研究现状  10-23
    1.2.1 低聚糖的分类及定义  10
    1.2.2 功能性低聚糖的分离纯化  10-12
    1.2.3 功能性低聚糖的检测及鉴定  12-14
    1.2.4 功能性低聚糖的生理活性  14-17
    1.2.5 功能性低聚糖的作用机理  17-18
    1.2.6 果胶低聚糖的来源及制备  18-19
    1.2.7 果胶低聚糖的化学结构及理化性质  19-20
    1.2.8 果胶低聚糖的应用现状  20-21
    1.2.9 果胶低聚糖的开发前景  21-23
第二章材料与方法  23-32
  2.1 试验材料与试剂  23-24
    2.1.1 试验材料  23
    2.1.2 试验试剂及主要试剂的配制  23-24
  2.2 试验仪器设备  24
  2.3 苹果果胶的制备及其含糖量的测定  24-25
    2.3.1 高甲氧基苹果果胶的制备  24
    2.3.2 苹果果胶中总糖含量的测定（苯酚-硫酸法）  24-25
    2.3.3 苹果果胶中半乳糖醛酸含量的测定（咔唑-硫酸法）  25
  2.4 低聚糖含量与得率的测定  25-27
    2.4.1 测定原理及路线  25-26
    2.4.2 测定方法  26-27
  2.5 反应体系的建立及酶促反应条件的优化  27-28
    2.5.1 反应体系的初步建立  27
    2.5.2 酶促反应条件的初选  27
    2.5.3 响应面法优化酶促反应工艺  27-28
  2.6 酶解产物抑菌活性测定  28
    2.6.1 功能性低聚糖的抑菌原理  28
    2.6.2 操作方法及步骤  28
  2.7 二价金属离子对酶活性的影响  28-29
    2.7.1 金属离子影响酶活性的原理  28
    2.7.2 操作方法及步骤  28-29
    2.7.3 酶比活及其变化率计算  29
  2.8 酶解产物的分离、纯化  29-31
    2.8.1 样品制备  29
    2.8.2 硅胶柱层析分离纯化  29-30
    2.8.3 凝胶过滤层析分离纯化  30-31
  2.9 不同洗脱组分抑菌活性的比较  31-32
第三章结果与分析  32-44
  3.1 各单因素对果胶酶催化活性的影响  32-35
    3.1.1 酶用量对低聚糖相对生成量的影响  32
    3.1.2 底物浓度对低聚糖相对生成量的影响  32-33
    3.1.3 反应温度对低聚糖相对生成量的影响  33-34
    3.1.4 pH 对低聚糖相对生成量的影响  34
    3.1.5 反应时间对低聚糖相对生成量的影响  34-35
    3.1.6 小结  35
  3.2 果胶酶催化工艺参数的优化  35-41
    3.2.1 响应面试验结果  35-39
    3.2.2 不同酶解条件下产物的抑菌活性  39-40
    3.2.3 二价金属离子对果胶酶活性的影响  40-41
    3.2.4 小结  41
  3.3 苹果果胶低聚糖的分离纯化  41-43
    3.3.1 硅胶柱层析分离纯化  41-42
    3.3.2 凝胶过滤层析分离纯化  42
    3.3.3 小结  42-43
  3.4 酶解产物不同组分抑菌活性的测定  43-44
第四章讨论与结论  44-47
  4.1 讨论  44-45
    4.1.1 pH 和酶浓度对果胶低聚糖生成量的作用  44
    4.1.2 不同分离介质对果胶低聚糖的分离效果  44
    4.1.3 酶解产物的抑菌差异性  44-45
    4.1.4 Ca~(2+)和Fe~(2+)对酶催化活性的影响  45
    4.1.5 Ca~(2+)和Fe~(2+)对DNS 法测定糖含量的影响  45
  4.2 结论  45-47
参考文献  47-50
致谢  50-51
作者简介  51

苹果果胶低聚糖的酶法制备、分离及其抑菌活性研究

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