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芦丁降解酶的固定化及其酶学特性研究

作　者: 崔会东
导　师: 陈鹏
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 苦荞芦丁降解酶固定化酶壳聚糖交联芦丁降解酶聚集体
分类号: Q814.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

苦荞是唯一作为粮用的蓼科(Polygonaceae)植物,是我国西部重要的药食兼用作物。黄酮类化合物是苦荞最主要的生物活性成分,赋予苦荞降血压,降血脂和降血糖等生理功能。苦荞中含有高活性的芦丁降解酶,该酶能专一性将芦丁水解为槲皮素和芸香糖。本论文研究了利用有载体和无载体两种条件下固定芦丁降解酶,并对固定化条件进行优化,研究了固定化酶的酶学特性。在有载体固定化中,采用共价结合法,以壳聚糖为载体固定化芦丁降解酶,分别在单因素试验的基础上进行了正交试验,确定了最佳工艺条件,结果表明:最适酶量和固定化pH对固定化酶活力影响高度显著,固定化温度和戊二醛浓度对固定化酶活力有影响,活化时间、活化温度和固定化时间对固定化酶影响最小,综合起来考虑,最优水平为戊二醛的浓度3%,活化时间1小时,活化温度30℃,酶浓度340μg/ml,固定化pH4.0时,固定化温度20℃,固定化时间5小时,酶活力回收率最高。将壳聚糖固定化酶和游离酶进行比较,结果显示壳聚糖固定化芦丁降解酶和游离酶最适温度分别为60℃和50℃,游离酶的最适pH为4.0,而固定化酶的最适pH为3.5。固定化酶的热稳定性提高,耐酸碱性范围扩大,更耐酸。在无载体固定化中,以交联酶聚集体作为固定化方法,在单因素试验的基础上进行正交试验,结果表明:pH对固定化酶活力的影响高度显著,交联温度对固定化有影响,戊二醛浓度、牛血清白蛋白浓度和交联时间及硫酸铵浓度对固定化影响最小,综合考虑,固定化最优水平为戊二醛的浓度0.5%,交联时间3小时,牛血清白蛋白浓度0.1mg/ml,固定化温度20℃,硫酸铵浓度100%,给酶量170μg/ml,固定化pH7时,酶活力回收率最高。将交联酶聚集体和游离酶进行比较,结果显示交联酶聚集体和游离酶最适温度无明显变化,均为50℃左右,交联酶聚集体的最适pH为3.8。热稳定性提高,耐酸碱性范围扩大。游离酶和交联酶的Km值分别分别为3.521μmolml-1和3.753μmol ml-1 ,说明交联芦丁降解酶聚集体和游离芦丁降解酶的对底物的亲合力只是微小的变化。对壳聚糖固定化的芦丁降解酶和交联酶聚集体进行比较,从制备流程来看,交联酶聚集体方法相对简单;从重复使用性上来看,壳聚糖球易破裂,重复使用效果差;从酶活力回收率来看,当游离酶酶比活力为346.52U/mg时,超过98%的游离酶被固定,交联酶聚集体比活力为323.06U/mg,活力回收率高,而壳聚糖为载体固定化仅有8%的酶被固定,酶活力回收率低,因此交联酶聚集体是固定化芦丁降解酶的较为适宜的方法。此外固定化酶对多种有机试剂的耐受性高于游离酶,这些结果为研究芦丁降解酶的非水酶学特性奠定了基础,同时该研究结果为利用苦荞芦丁降解酶酶法生产槲皮素以及拓展生物催化领域酶的种类有具有重要的理论意义和指导价值。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-11
第一章文献综述  11-26
  1.1 苦荞麦的化学成分与药用价值  11-14
    1.1.1 苦荞麦的化学成份  11-13
    1.1.2 苦荞麦的药用价值  13-14
  1.2 苦荞中芦丁的功效与研究现状  14-15
  1.3 槲皮素的功效与研究现状  15-16
  1.4 苦荞中的芦丁降解酶  16
  1.5 酶的固定化  16-25
    1.5.1 固定化酶的发展史、定义  16-17
    1.5.2 酶固定化技术的分类  17-23
    1.5.3 固定化酶的应用  23-25
  1.6 选题的目的、意义及主要研究内容  25-26
    1.6.1 选题的目的、意义  25
    1.6.2 主要研究内容  25-26
第二章壳聚糖微球固定化芦丁降解酶及酶学特性研究  26-42
  2.1 材料  26
    2.1.1 实验材料与试剂  26
    2.1.2 仪器与设备  26
  2.2 研究内容  26-29
    2.2.1 芦丁降解酶的制备  26
    2.2.2 芦丁降解酶活力的测定标准曲线绘制  26-27
    2.2.3 蛋白质含量测定方法  27
    2.2.4 壳聚糖微球的制备  27
    2.2.5 壳聚糖微球固定化芦丁降解酶的方法  27-28
    2.2.6 壳聚糖微球固定化芦丁降解酶条件的优化  28
    2.2.7 壳聚糖微球固定化芦丁降解酶的特性研究  28-29
  2.3 结果与讨论  29-41
    2.3.1 槲皮素含量标准曲线  29-30
    2.3.2 壳聚糖微球的制备  30-31
    2.3.3 壳聚糖微球固定化芦丁降解酶的方法  31-35
    2.3.4 壳聚糖微球固定化芦丁降解酶条件的优化  35-37
    2.3.5 固定化芦丁降解酶酶学的特性研究  37-41
  2.4 小结  41-42
第三章交联芦丁降解酶聚集体的制备及其酶学特性研究  42-57
  3.1 材料  42
    3.1.1 实验材料与试剂  42
    3.1.2 仪器与设备  42
  3.2 实验方法  42-44
    3.2.1 芦丁降解酶的活性测定及标准曲线的绘制  42
    3.2.2 蛋白质含量测定方法  42
    3.2.3 游离酶沉淀条件的优化  42
    3.2.4 交联芦丁降解酶聚集体的制备  42-43
    3.2.5 交联芦丁降解酶聚体的优化  43
    3.2.6 交联芦丁降解酶聚集体酶学特性研究  43-44
  3.3 结果与分析  44-55
    3.3.1 芦丁降解酶沉淀条件的优化  44-45
    3.3.2 交联芦丁降解酶聚集体的制备  45-49
    3.3.3 交联芦丁降解酶聚集体制备的优化  49-51
    3.3.4 交联芦丁降解酶聚集体的酶学特性研究  51-55
  3.4 壳聚糖微球固定化的芦丁降解酶与交联酶聚集体酶学特性的比较  55-56
    3.4.1 制备流程  55-56
    3.4.2 酶活力回收率  56
    3.4.3 酶催化重复利用率  56
  3.5 本章小结  56-57
第四章结论  57-59
  4.1 结论  57
  4.2 创新点  57-58
  4.3 展望  58-59
参考文献  59-64
缩略词  64-65
致谢  65-66
作者简介  66

芦丁降解酶的固定化及其酶学特性研究

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