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苦荞籽粒芦丁降解酶的纯化与其酶学性质研究

作　者: 顾继娟
导　师: 陈鹏
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 苦荞芦丁降解酶特性纯化多克隆抗体
分类号: Q946.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

随着人们生活水平的提高,“三高”疾病（高血压、高血脂、高血糖）因其高发病率、高致残率、高致死率,已成为备受关注的社会性健康问题。在“三高”疾病的防治中,生物类黄酮物质发挥着十分重要的作用,并为医学界所普遍认可。苦荞以其丰富的营养价值和独特的药用价值,被推崇为“21世纪最有前途的绿色食品”。苦荞籽粒含有丰富的生物类黄酮物质,其中芦丁约占总量的80%。芦丁具有多方面的生理功能,有抗氧化性、降血压、预防心脑血管疾病等功效。然而,苦荞含有高活性、高耐受性的芦丁降解酶,极大地限制了芦丁的提取、加工和利用。本研究利用硫酸铵沉淀法、疏水层析法、阳离子交换层析法、凝胶过滤层析法和电泳技术分离纯化苦荞籽粒中的芦丁降解酶,纯化蛋白在PAGE以及SDS-PAGE皆为单一条带,纯化倍数和得率分别为13.15和7.39%,SDS-PAGE显示其分子量为66kD。以纯化的蛋白为抗原免疫兔子,获得效价为1:10000的高效价多克隆抗体,该结果为进一步研究芦丁降解酶的生理功能奠定了基础。利用EDMAN降解法,测定得到芦丁降解酶N端15个氨基酸序列为:TVSRSSFPDGFLFGL,利用在线Blast软件分析该氨基酸序列,未得到已报道的相似序列。同时对纯化的蛋白进行基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱法（MALDI- TOF-MS）分析,肽指纹图谱比对未发现有报道的相似蛋白。芦丁降解酶的活性和稳定性研究表明,该酶在pH3.0～8.0之间皆有活性,其最适的pH值为5.0,且在该pH值时酶最为稳定。在温度为20℃～70℃之间,芦丁降解酶皆存在活性,其最适温度和最稳定温度为50℃。芦丁降解酶动力学研究表明,该酶的Km值和Vmax值分别为0.17mol/L和39.6U mg^-1。Cu²⁺、Al³⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、EDTA皆对芦丁降解酶活性有不同程度的抑制作用。本研究还在SDS-PAGE基础上建立了SDS-PAGE检测芦丁降解酶活性的分析方法,该方法极大地提高了酶检测方法的分辨率。结论:建立从苦荞籽粒（榆6-21）中分离纯化芦丁降解酶的方法,并且对该酶进行了研究,从而为芦丁降解酶的基因克隆、芦丁在苦荞中生理代谢机制、以及芦丁降解酶在芦丁代谢途径中的地位研究奠定了基础。

全文目录

摘要  6-7
ABSTRACT  7-11
第一章文献综述  11-26
  1.1 荞麦的简介  11-14
    1.1.1 苦荞的简介  11-12
    1.1.2 苦荞保健及药用功能简介  12-14
  1.2 黄酮类物质的研究现状  14-16
    1.2.1 黄酮类物质的代谢合成途径  14
    1.2.2 黄酮类物质的生理和药理功能  14-16
  1.3 芦丁的研究进展  16-19
    1.3.1 芦丁的提取工艺  16-17
    1.3.2 芦丁的药理研究  17-18
    1.3.3 芦丁药效学研究  18
    1.3.4 苦荞中芦丁的研究进展  18-19
  1.4 层析技术简介  19-22
    1.4.1 疏水层析的基本原理  19-20
    1.4.2 离子交换层析的基本原理  20-21
    1.4.3 凝胶过滤层析的基本原理  21
    1.4.4 层析技术的应用和研究  21-22
  1.5 芦丁和芦丁降解酶的研究进展  22-24
    1.5.1 研究进展  22-23
    1.5.2 芦丁降解酶活性的测定方法  23-24
  1.6 立题依据和实验研究路线  24-26
第二章芦丁降解酶分离纯化以及多克隆抗体的制备  26-39
  2.1 材料  26-29
    2.1.1 苦荞  26
    2.1.2 试剂和耗材  26
    2.1.3 缓冲液  26-27
    2.1.4 层析材料及其试剂  27
    2.1.5 电泳试剂  27-28
    2.1.6 芦丁降解酶活性测定试剂  28
    2.1.7 转膜试剂  28-29
  2.2 实验方法  29-35
    2.2.1 芦丁降解酶活性测定方法  29
    2.2.2 芦丁降解酶粗酶液制备  29
    2.2.3 芦丁降解酶硫酸铵分级沉淀  29-30
    2.2.4 芦丁降解酶疏水层析  30
    2.2.5 芦丁降解酶离子交换层析  30-31
    2.2.6 芦丁降解酶凝胶过滤层析  31-32
    2.2.7 蛋白质含量测定  32
    2.2.8 聚丙烯酰胺凝胶电泳  32-33
    2.2.9 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)  33-34
    2.2.10 芦丁降解酶质谱鉴定  34
    2.2.11 多克隆抗体制备  34
    2.2.12 芦丁降解酶的N 端氨基酸测序  34-35
  2.3 结果和分析  35-37
    2.3.1 芦丁降解酶的纯化分离  35-36
    2.3.2 芦丁降解酶质谱分析  36
    2.3.3 芦丁降解酶N 端氨基酸测序  36-37
  2.4 讨论  37-39
第三章芦丁降解酶促动力学研究  39-46
  3.1 材料  39-40
    3.1.1 实验材料  39
    3.1.2 试剂  39
    3.1.3 溶液配制  39-40
    3.1.4 仪器  40
  3.2 实验方法  40-41
    3.2.1 pH 值对芦丁降解酶活性和稳定性的影响  40
    3.2.2 温度对芦丁降解酶活性和稳定性的影响  40
    3.2.3 测定芦丁降解酶的Km 值和Vmax 值  40
    3.2.4 金属离子以及EDTA 对芦丁降解酶活性的影响  40-41
    3.2.5 SDS-PAGE 测定苦荞种子芦丁降解酶活性  41
  3.3 结果与分析  41-44
    3.3.1 pH 值对芦丁降解酶活性和稳定性的影响  41-42
    3.3.2 温度对芦丁降解酶活性和稳定性的影响  42-43
    3.3.3 芦丁降解酶的Km 值和Vmax 值  43
    3.3.4 金属离子对芦丁降解酶活性的影响  43-44
    3.3.5 SDS-PAGE 检测苦荞种子中芦丁降解酶活性  44
  3.4 讨论  44-46
第四章研究的意义、特色与取得的成果  46-48
  4.1 研究的意义  46
  4.2 研究的特色  46
  4.3 研究所取得的主要成果  46-48
参考文献  48-56
致谢  56-57
作者简介  57

苦荞籽粒芦丁降解酶的纯化与其酶学性质研究

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