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Lactobacillus collinoides二醇脱水酶及其激活因子的功能鉴定

作　者: 梁甜
导　师: 黄日波
学　校: 广西大学
专　业: 微生物学
关键词: 1，3-丙二醇 二醇脱水酶 甘油脱水酶 激活因子 Lactobacillus collinoides
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


甘油脱水酶(EC 4.2.1.30)是生物转化法生产1，3-丙二醇(工业上有重要用途的化工材料)的限速酶，而二醇脱水酶(EC4.2.1.28)是甘油脱水酶的同工酶，所以近年来也成为研究的热点。以Lactobacillus collinoides基因组DNA为模板，PCR扩增得到了二醇脱水酶基因(pduCDE)及其激活因子基因(pduGH)，分别连接到pSE380和pET30a(+)中，构建了重组质粒pSE-pduCDE与pET-pduGH，两外源基因分别在E.coli JM109和E.coli rosseta(DE3)中得到表达。经SDS-PAGE分析表明，pduCDE基因的表达蛋白包括63kDa、28kDa、22kDa三个亚基，结果与预期的相符；pduGH基因的表达蛋白包括64.5 kDa、12.4 kDa两个亚基，结果与预期的相符。重组菌中的二醇脱水酶基因pduCDE表达产物不具备脱水酶活力，与Lactobacillus diolvorans二醇脱水酶基因在E.coli(BL21)中的重组表达情况一致。重组质粒pET-pduGH的表达蛋白，在E.coli(DE3)中形成不溶性的包涵体，经变性和复性后再经进一步酶功能鉴定，在国内外首次证明，复性后的pET-pduGH表达蛋白能激活Glostridipasteurianum甘油脱水酶um，具有甘油脱水酶激活因子活性。

全文目录


摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
目录  9
第一章 前言  9-16
  1.1 1,3-丙二醇的工业用途  9-10
  1.2 微生物发酵生产1,3-PD  10-13
  1.3 Lactobacillus collinoides二醇脱水酶及其激活因子的研究意义  13-16
第二章 材料与方法  16-25
  2.1 材料  16-17
    2.1.1 菌株与质粒  16
    2.1.2 酶与试剂  16
    2.1.3 主要仪器设备  16-17
  2.2 方法与步骤  17-25
    2.2.1 L.collinoides的培养  17
    2.2.2 菌种的保存  17
    2.2.3 L.collinoides基因组DNA的制备  17-18
    2.2.4 pduCDE基因与pduGH基因的引物设计和PCR扩增  18-19
    2.2.5 大肠杆菌感受态的制备  19
    2.2.6 质粒DNA的小量制备  19-20
    2.2.7 DNA的酶切与连接  20
    2.2.8 连接产物化学转化大肠杆菌感受态细胞  20
    2.2.9 阳性克隆的筛选和酶切验证  20-21
    2.2.10 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达  21
    2.2.11 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳  21
    2.2.12 pduGH达产物(包涵体)的溶解和复性  21-22
    2.2.13 蛋白质浓度测定  22
    2.2.14 pduGH日表达产物(包涵体)的纯化  22-23
    2.2.15 L.collinoides二醇脱水酶和激活因子活力的检测  23-25
第三章 结果与分析  25-34
  3.1 L.collinoides基因组总DNA的制备  25
  3.2 L.collinoides二醇脱水酶基因(pduCDE)的克隆表达  25-29
    3.2.1 二醇脱水酶基因(pduCDE)表达质粒的构建  25-27
    3.2.2 pduCDE基因的序列分析  27
    3.2.3 pduCDE基因表达产物的SDS-PAGE分析  27-28
    3.2.4 重组菌中二醇脱水酶活力的测定  28-29
  3.3 L.collinoides二醇脱水酶激活因子(pduGH)的克隆表达  29-32
    3.3.1 表达质粒pET-pduGH的构建  29-30
    3.3.2 pduGH基因的序列分析  30
    3.3.3 pduGH基因表达产物的SDS-PAGE分析  30-32
  3.4 包涵体的复性效果分析  32
  3.5 pduGH基因表达产物的酶功能检验  32-34
第四章 讨论  34-39
  4.1 L.collinoides二醇脱水酶  34-35
  4.2 L.collinoides二醇脱水酶激活因子  35-38
  4.3 pduGH表达产物形成包涵体复性  38-39
第五章 结论  39-41
  5.1 结论  39
  5.2 展望  39-41
参考文献  41-49
附录  49-55
致谢  55-56
攻读学位期间发表的学术论文  56

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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