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萝卜雄性不育胞质类型鉴定与分析

作　者: 马二磊
导　师: 龚义勤；柳李旺
学　校: 南京农业大学
专　业: 蔬菜学
关键词: 萝卜细胞质雄性不育胞质鉴定分子标记辅助选择小孢子发生
分类号: S631.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

萝卜(Raphanus sativus L.)是起源于我国的重要十字花科蔬菜,具有显著的杂种优势。雄性不育是植物不能产生具有功能的花粉,而雌蕊和营养生长正常,是利用杂种优势的重要途径。Ogura胞质是最早发现也是研究最为充分的CMS类型,目前,Ogura胞质已被广泛用于杂交种的商业化生产。但生产上利用的萝卜雄性不育系多为Ogura胞质,胞质的单一化易造成品种对外界胁迫抵抗的脆弱性,具有可能导致生产上无法挽回损失的风险。如1970年玉米小斑病T小种的爆发流行,导致美国玉米产业遭受严重的经济损失。萝卜种质资源胞质鉴定的技术体系尚未建立,小孢子发生过程的败育机理未完全阐明,不育系转育时优良保持系的筛选比较困难,分子标记辅助选择筛选保持系的技术体系还不健全。有鉴于此,本研究分别进行了不同萝卜种质的胞质鉴定、小孢子败育过程的细胞学观察和标记辅助筛选保持系的研究,以期为萝卜胞质的快速鉴定、小孢子败育机理的揭示、保持系的快速筛选与不育系的高效利用提供重要的技术基础。(1)依据atp6和orf138基因设计胞质鉴定引物对231份萝卜自交系、不育系配制组合以及48个商品种进行扩增,根据不同的条带模式,将萝卜胞质区分为DBRMF1, DBRMF2,交叉型和Ogura四种类型。55份自交系和品种是DBRMF1类型,只能扩增出835bp的片段；23份自交系和品种是DBRMF2类型,只能扩增出910bp的片段；62份材料是交叉型,既能扩增出orf138片段,也能扩增出835bp或910bp的片段；139份材料是Ogura类型,只能扩增出orf138片段。orf138是决定Ogura CMS的关键因子,据此认为交叉型和Ogura类型材料是Ogura胞质。本研究利用不育基因分子标记对萝卜胞质进行鉴定和分类,为萝卜种质资源的合理利用与评价提供重要的技术基础。(2)以不同萝卜雄性不育系及其保持系(NAUCHUNDG×SDG、NAUZAOC×SDG. NAUDAS×SDG、SDG).育性出现分化的杂交组合(NAUDAS×SNYR. NAUCHUNDG×SNYR、SNYR)和半不育组合(BAIYC)为材料,采用石蜡切片法对其进行小孢子发生的细胞学观察。结果表明：不同不育系的败育方式相似,四分体之前的小孢子发育情况一致,四分体之后绒毡层异常膨大解体,不能为单核小孢子提供能量造成败育；育性分化材料的败育表现高度一致,四分体时期后表现差异,可育材料正常发育形成小孢子,不育材料的绒毡层挤压小孢子最终一同降解造成不育；半不育材料的显著特点是绒毡层挤压小孢子后,单核小孢子降解不彻底,仍有部分小孢子发育为成熟花粉粒。本研究比较了不同类型萝卜材料的小孢子发生过程,以确定小孢子的败育时期与方式,阐明小孢子的败育机理,为胞质鉴定提供重要的细胞学参考。(3)以15份自交系和17份不育系配制的杂交组合为材料,利用检测orf138和orf158基因的引物对其进行扩增。引物Lw oguspecific 138FR可在21份材料扩增出orf138特异条带,而引物Lw 158FR可在所有材料扩增出orf158的片段。结果表明21份材料为Ogura胞质,15份自交系中4份包含恢复基因不能作为候选保持系；11份自交系不包含orf138基因适宜作为候选保持系。选择性状较好的雄性不育源,以筛选的候选保持系为父本进行回交转育,淘汰育性分离的自交系,结合杂交组合的田间性状表现进行定向选择,从而培育新型不育系用于萝卜的杂交制种。本研究利用不育基因分子标记结合田间性状鉴定快速筛选优异保持系,可以减少大量测交的时间与工作量,提高不育胞质的转育效率,加快利用CMS进行优良F1品种选育进程。

全文目录

目录  4-6
摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
缩略词表  10-11
引言  11-12
第一章文献综述萝卜雄性不育性研究进展  12-21
  1. 萝卜线粒体基因组研究  12-14
    1.1 以短重复序列为介导的萝卜mtDNA重组  12-13
    1.2 萝卜线粒体基因组与雄性不育  13-14
  2 萝卜小孢子败育的细胞学研究  14-15
  3 萝卜CMS类型鉴定  15-19
    3.1 萝卜细胞质雄性不育类型  15-16
    3.2 萝卜胞质类型鉴定方法  16-18
      3.2.1 植株田间形态学观察  16-17
      3.2.2 小孢子发育观察  17
      3.2.3 测交法  17
      3.2.4 细胞器基因组检测  17-18
    3.3 萝卜胞质鉴定基因atp6研究  18-19
  4 雄性不育在萝卜杂种生产中的应用  19-21
第二章萝卜胞质类型鉴定及其分子标记分析  21-33
  1 材料与方法  23-26
    1.1 材判  23
    1.2 基因组DNA提取  23-24
    1.3 PCR扩增  24
    1.4 atp6基因的克隆与测序  24-26
      1.4.1 目的片段回收  24
      1.4.2 感受态大肠杆菌的制备  24-25
      1.4.3 重组质粒的构建  25
      1.4.4 重组质粒的转化  25-26
      1.4.5 质粒的提取和重组质粒的鉴定  26
      1.4.6 测序  26
  2 结果与分析  26-31
    2.1 萝卜胞质鉴定引物扩增  26-27
    2.2 供试萝卜材料胞质类型鉴定  27-28
    2.3 供试材料胞质鉴定结果统计  28
    2.4 常胞质片段的克隆测序与BLAST分析  28-31
      2.4.1 克隆测序  28-30
      2.4.2 同源性BLAST分析  30-31
  3 讨论  31-33
    3.1 线粒体atp6基因与胞质鉴定  31
    3.2 新条带模式的发现  31
    3.3 短重复序列的高度重组  31-32
    3.4 分子标记在胞质鉴定的应用  32-33
第三章萝卜胞质雄性不育的细胞学鉴定  33-41
  1 材料与方法  35
    1.1 材料  35
    1.2 方法  35
  2 结果与分析  35-39
    2.1 不同萝卜雄性不育系的细胞学观察  35-37
    2.2 育性分化杂交组合的细胞学观察  37
    2.3 半不育材料的细胞学观察  37-39
  3 讨论  39-41
    3.1 小孢子败育的细胞学特征  39-40
    3.2 小孢子败育时期与方式  40-41
第四章利用标记辅助选择培育不育系  41-51
  1 材料和方法  42-45
    1.1 试验材料  42-43
    1.2 材料的保存  43
    1.3 基因组DNA提取  43
    1.4 PCR扩增  43-44
    1.5 扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶检测  44-45
  2 结果与分析  45-48
    2.1 萝卜雄性不育胞质鉴定  45-46
    2.2 保持系的分子标记筛选  46-47
    2.3 不育系的培育  47-48
      2.3.1 NAUBAIYCSN的培育  47
      2.3.2 NAUZAOC的培育  47-48
      2.3.3 NAUDAS的培育  48
    2.4 自交系基因型推测  48
  3 讨论  48-51
    3.1 保持系的分子标记辅助筛选  48-49
    3.2 优良不育系的转育  49-51
全文结论  51-52
参考文献  52-59
硕士在读期间发表论文情况  59-60
致谢  60

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