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两栖动物缓激肽基因的首次克隆、特征及可能的免疫调节关联分析

作　者: 陈曼达
导　师: 赖仞
学　校: 南京农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 两栖动物皮肤缓激肽基因
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

两栖动物皮肤中含有丰富的生物活性物质资源,其中缓激肽是一类与哺乳动物激素和神经传递素相类似的生物活性肽类,在两栖动物中超过10种缓激肽相关肽和它们的cDNA序列已经被确定,但是它们的基因序列还未见报道。本研究构建了无指盘臭蛙(Odorrana grahami)皮肤的cDNA文库,从中筛选到4条编码缓激肽前体的cDNA序列,它们所编码的缓激肽前体有着高度保守的信号肽、酸性间隔肽和成熟的缓激肽区域,分别含有1、2、4和6个成熟的缓激肽拷贝。根据这些cDNA序列,以无指盘臭蛙皮肤总DNA为模板,利用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)等方法,本研究还成功获得了首条两栖动物缓激肽基因序列。该基因含有7481个碱基,包含2个外显子和2个内含子,第1个外显子编码信号肽,第2个外显子编码酸性间隔肽、N端延伸区、成熟缓激肽和C端延伸区,在两个外显子中有一个内含子序列,在cDNA序列5’端非翻译区中也含有一个内含子。利用转录因子结合位点数据库对该基因的启动子区域进行分析,发现该启动子序列包含有SRY、LYF-1、GATA-1、DeltaE、S8、CdxA、MZF1、NKX2.5和MIF1等转录因子结合位点。现在还不能确定这些结合位点在两栖动物缓激肽基因中所扮演的角色,但该基因序列的获得将有利于了解两栖动物皮肤中缓激肽相关肽的调节机制和功能,尤其是在该基因序列中发现的一些跟免疫防御有关的转录因子结合位点,暗示两栖动物缓激肽可能具有与调节免疫相关的防御功能,无指盘臭蛙缓激肽前体序列和抗菌肽序列的信号肽区域具有很高的相似性也支持这一结论。从这4条cDNA序列编码的两栖动物缓激肽前体中获得了3种缓激肽相关肽(bradykinin, Thr6-bradykinin和Leu5Thr6-bradykinin)。为了弄清基因中这3种肽的区别,更好地了解两栖动物皮肤中缓激肽的功能,本研究合成了其中的bradykinin (RPPGFSPFR)和Leu5Thr6-bradykinin (RPPGLTPFR),对它们的功能进行研究。结果表明这2种肽均能引起豚鼠离体回肠剂量依赖型的收缩反应,而且虽然两者只有两个氨基酸不一样,其引起的收缩活力还是有很大的区别,在同一浓度下检测,bradykinin引起的豚鼠离体回肠收缩活力总要强于Leu5Thr6-bradykinin。

两栖动物缓激肽基因的首次克隆、特征及可能的免疫调节关联分析

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