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一株黄瓜枯萎病拮抗细菌的分离鉴定及其相关特性的研究

作　者: 乔胜伟
导　师: 沈标
学　校: 南京农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 黄瓜枯萎病尖孢镰刀菌短小芽孢杆菌拮抗生物防治
分类号: S436.421
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

黄瓜枯萎病是一种对黄瓜种植生产有着严重影响的土传病害,在瓜类等蔬菜种植地多有发生,其病原菌为尖孢镰刀菌。传统的防治方法是施用化学农药,但药物残留、耐药性等多种副作用对食品安全、环境构成了巨大威胁。生物防治方法因为作用明显、对环境相对安全,有利于农业的可持续发展和生态环境的改善而受到人们的重视。从采自山东、云南、陕西等地的蔬菜大棚土壤中分离筛选出一株对黄瓜枯萎病有明显抑制作用的拮抗细菌YHJ15,经过形态观察、生理生化特征分析和16S rDNA序列测定,将其初步鉴定为短小芽孢杆菌。该菌适于生长于pH5-7中性偏酸的环境,对氧气的需求量比较大,适于生长的NaCl浓度比较宽。其生长最适宜的碳源和氮源分别是半乳糖和牛肉膏。对抗生素的敏感性较高,尤其对林可霉素比较敏感。在15-35℃范围内,生长速度没有明显差异。另外,YHJ15能够产生几丁质酶等。通过对峙实验,YHJ15的发酵液表现出对黄瓜枯萎病病原菌的明显抑制效果,而且发酵液经过121℃,30min高压灭菌后,抑制效果下降不明显。YHJ15的挥发性代谢产物对病原菌有一定的抑制效果,但是相对抑菌率仅有25.5%；非挥发性代谢产物对病原菌菌丝抑制效果则较高,相对抑菌率可达48.9%。发酵液对黄瓜种子的发芽率未表现出抑制作用。发酵液拮抗活性的优化试验结果表明,最佳碳源为葡萄糖,最佳氮源为大豆蛋白胨,最佳pH为7-8,最佳接种量为2.5%,30mL/250mL为最佳装液量,35h范围为最适培养时间,25-35℃为最佳温度范围。本文还对YHJ15的拮抗物质的理化性质做了初步探索。发酵液经70%硫酸铵沉淀所获得的粗提物的拮抗效果最好,拮抗物质能够经过50-100℃、30min处理后,拮抗活性有所下降。拮抗物质对酸性环境比较稳定,但对碱性环境比较敏感,表现在pH5-8时抑菌活性较高,在pH超过12时拮抗物质几乎没有抑菌活性。经过蛋白酶处理后,拮抗物质均有一定程度的活性下降,下降幅度均超过了50%。拮抗物质对紫外线有一定敏感性,但下降幅度与紫外线强度、辐射时间无严格正相关关系。拮抗物质对氯仿不敏感。经过常温和4℃放置处理,拮抗物质的相对抑菌率会随时间延长而降低,常温放置时,第14d即可有沉淀析出,第2个月时相对抑菌率已经下降至34.27%,第6个月时已经无法检出抑菌活性。而在4℃放置时,在到第4个月时拮抗活性才有明显降低。拮抗物质对于0.2mol/L-1.0mol/L浓度范围的NaCl不敏感。另外拮抗物质的粗提液的活性经高压灭菌后显著下降,相对抑菌率下降至37.29%,说明拮抗物质中有一部分对高温敏感,也有部分对高温不甚敏感。

全文目录

摘要 7-9ABSTRACT 9-11第一章文献综述 11-25 1 黄瓜枯萎病的概述和防治现状 11 2 生物防治 11-14 2.1 微生物与生物防治 12-13 2.2 黄瓜枯萎病的生物防治 13-14 3 植物病害生防的机理 14-16 3.1 拮抗作用 14 3.2 抗生作用 14 3.3 竞争作用 14-15 3.4 重寄生作用 15 3.5 交叉保护作用 15 3.6 诱导抗性作用 15-16 4 拮抗细菌在植物病害防治中的优势及主要应用途径 16-17 4.1 拮抗细菌在植物病害防治中的优势 16-17 4.2 拮抗细菌在植物病虫害防治中的主要施用方式 17 5 拮抗微生物产生的拮抗物质 17-19 6 生物防治的发展前景 19 7 技术路线 19-21 参考文献 21-25第二章拮抗菌的分离鉴定和理化性质的研究 25-41 1 材料和方法 25-29 1.1 菌株、培养基与试剂 25-26 1.2 拮抗菌YHJ15的分离和鉴定 26-28 1.3 YHJ15系统发育地位的确定 28 1.4 环境条件对拮抗菌生长量的影响 28-29 1.5 YHJ15产酶研究 29 2 结果与讨论 29-39 2.1 拮抗菌YHJ15的分离 29-30 2.2 YHJ15的形态特征和生理生化特性 30 2.3 YHJ15的16S rDNA鉴定 30-33 2.4 环境条件对YHJ15生长的影响 33-37 2.5 YHJ15的胞外酶特性 37-39 参考文献 39-41第三章拮抗菌的离体抑菌效果和拮抗物质产生条件的优化 41-51 1 材料和方法 41-42 1.1 材料 41 1.2 试验方法 41-42 2 拮抗菌YHJ15拮抗活性发酵条件的优化 42-44 2.1 发酵浓缩液的制备 43 2.2 抑菌圈的观察 43 2.3 不同碳源对抑菌效果的影响 43 2.4 不同氮源对抑菌效果的影响 43 2.5 不同初始pH对抑菌效果的影响 43-44 2.6 不同接种量对抑菌效果的影响 44 2.7 不同通气量对抑菌效果的影响 44 2.8 不同培养时间对抑菌效果的影响 44 3 结果与讨论 44-50 3.1 拮抗菌YHJ15发酵液对病原菌菌丝的抑制作用 44-45 3.2 拮抗菌YHJ15挥发性代谢产物对病原菌的抑制作用 45 3.3 拮抗细菌非挥发性代谢产物对病原菌的抑制作用 45-46 3.4 拮抗细菌发酵液对于黄瓜种子发芽率的影响 46 3.5 碳源对抑菌效果的影响 46-47 3.6 氮源对抑菌效果的影响 47 3.7 初始pH对抑菌效果的影响 47-48 3.8 接种量对抑菌效果的影响 48 3.9 通气量对抑菌效果的影响 48-49 3.10 培养时间对于抑菌效果的影响 49 3.11 培养温度对抑菌效果的影响 49-50 参考文献 50-51第四章拮抗物质的粗提及其稳定性的初步研究 51-59 1 材料和方法 51 1.1 材料 51 1.2 实验方法 51 2 拮抗物质的粗提和稳定性研究 51-52 2.1 拮抗细菌菌株的活化和种子液的获得 51 2.2 无菌发酵液的获得 51-52 2.3 拮抗物质的粗提取和最佳(NH_4)_2SO_4饱和度的确定 52 3 YHJ15拮抗物质粗提取液理化性质研究 52-54 3.1 对温度的稳定性 52 3.2 YHJ15拮抗物质对pH的稳定性 52 3.3 对蛋白酶的稳定性 52-53 3.4 对紫外线的稳定性 53 3.5 对氯仿的稳定性 53 3.6 对不同保存温度、保存时间的稳定性 53 3.7 对离子强度的稳定性 53-54 4 结果与讨论 54-58 4.1 最佳(NH_4)_2SO_4饱和度的确定 54 4.2 拮抗物质粗提取物对温度的稳定性 54-55 4.3 拮抗物质粗提取液对pH的稳定性 55 4.4 拮抗物质粗提取液对蛋白酶的稳定性 55-56 4.5 拮抗物质粗提取液对紫外线的稳定性 56 4.6 拮抗物质粗提取液对氯仿的稳定性 56 4.7 拮抗物质粗提取液对不同保存温度、保存时间的稳定性 56-57 4.8 拮抗物质粗提取液对离子强度的稳定性 57-58 参考文献 58-59致谢 59

一株黄瓜枯萎病拮抗细菌的分离鉴定及其相关特性的研究

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