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流式荧光微球技术免疫检测氯霉素和盐酸克伦特罗残留

作　者: 高海霞
导　师: 蒋继志；邹明强；曲占良
学　校: 河北大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 氯霉素 盐酸克伦特罗 流式荧光微球技术 荧光微球 流式细胞仪
分类号: S859.84
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


氯霉素(chloramphenicol)和盐酸克伦特罗(clenbuterol hydrochloride)曾作为饲料添加剂广泛应用于畜牧业生产。然而,在使用中人们发现其在动物源性食品中残留会引起严重的后果,威胁人们的身体健康。目前已被列为禁用兽药,但是一些不法商人为了追求经济利益依然非法使用。虽然检测氯霉素和盐酸克伦特罗残留的方法很多,如气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、质谱法(MS)、酶联免疫法(ELISA)、荧光免疫法(FIA)等,但是这些方法或存在操作步骤复杂,仪器价格昂贵的缺点,或是灵敏度不够高、信息量低、只能进行单目标检测。因此,建立快速、灵敏、同步检测氯霉素和盐酸克伦特罗的方法,对于保护消费者利益,对于食品安全检测以及国际贸易都有重要的意义。本研究在制备偶联抗原、荧光探针等相关试剂的基础上,应用流式荧光微球技术建立了一种高通量、快速、灵敏检测氯霉素、克伦特罗等兽药残留的方法。结果表明,氯霉素、盐酸克伦特罗分别通过重氮化法与牛血清白蛋白连接合成了偶联抗原,经紫外、生物质谱实验证明半抗原与载体蛋白偶联成功,偶联比分别为13和16。异硫氰酸荧光素标记氯霉素单克隆抗体和克伦特罗单克隆抗体制备荧光探针,经毛细管电泳、荧光分光光度计分析证明连接成功,通过流式细胞仪可以检测到荧光探针的信号。氯霉素偶联抗原为10μg或克伦特罗偶联抗原为5μg条件下与荧光微球的偶联效率最高；氯霉素单克隆抗体和克伦特罗单克隆抗体分别在220ng/mL和70.5ng/mL条件下,应用流式荧光微球技术检测氯霉素和克伦特罗的灵敏度最高。检测限分别为0.05ng/mL、0.01ng/mL,高于ELISA检测的灵敏度(0.1ng/mL、0.5ng/mL)。检测范围分别为0.05-100ng/mL、0.01-100ng/mL,且从检测微球制备到得到检测结果仅需3.5小时。将建立的流式荧光微球技术用于检测猪尿中氯霉素、克伦特罗残留,平均加标回收率为96%-119%,检测脱脂奶粉中氯霉素、克伦特罗残留,平均加标回收率为96%-102.4%,其准确度和重现性令人满意,显示了流式荧光微球技术的优越性。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-12
第1章 序言  12-26
  1.1 氯霉素  12-16
    1.1.1 氯霉素药物的概况  12-13
    1.1.2 氯霉素残留的危害  13
    1.1.3 氯霉素的检测方法研究  13-16
  1.2 盐酸克伦特罗  16-20
    1.2.1 盐酸克伦特罗药物的概况  16
    1.2.2 盐酸克伦特罗残留的危害  16-17
    1.2.3 盐酸克伦特罗的检测方法研究  17-20
  1.3 流式荧光微球技术  20-25
    1.3.1 技术背景  20-22
    1.3.2 技术优势  22
    1.3.3 流式荧光微球技术的原理  22-24
    1.3.4 流式荧光微球技术的应用现状  24-25
  1.4 本研究的目的与意义  25
  1.5 创新点  25-26
第2章 实验材料与方法  26-38
  2.1 实验材料与仪器  26-28
    2.1.1 材料和试剂  26-27
    2.1.2 主要仪器  27
    2.1.3 溶液系统  27-28
  2.2 流式荧光微球技术检测氯霉素的实验方法  28-33
    2.2.1 氯霉素偶联抗原合成及偶联比测定  28
    2.2.2 荧光素标记氯霉素单克隆抗体  28-29
    2.2.3 FITC-CAP单克隆抗体交联物的鉴定  29-30
    2.2.4 流式荧光微球技术检测CAP方法的建立  30-32
    2.2.5 竞争性ELISA方法检测CAP的建立  32-33
  2.3 流式微球技术检测克伦特罗的实验方法  33-36
    2.3.1 克伦特罗偶联抗原的合成  33-34
    2.3.2 克伦特罗偶联抗原鉴定  34-35
    2.3.3 荧光素标记克伦特罗单克隆抗体  35
    2.3.4 FITC-CAP单克隆抗体交联物的鉴定  35
    2.3.5 流式荧光微球技术检测CAP方法的建立  35-36
    2.3.6 竞争性ELISA方法检测CL  36
  2.4 流式荧光微球技术同步检测CL和CAP残留  36-38
    2.4.1 检测方案  36
    2.4.2 交叉反应性考察  36-37
    2.4.3 实际样品检测  37-38
第3章 结果与分析  38-52
  3.1 流式荧光微球技术检测氯霉素  38-45
    3.1.1 氯霉素偶联抗原的生物质谱测定  38-39
    3.1.2 CAP单克隆抗体与FITC的交联物的鉴定  39-40
    3.1.3 微球表面氯霉素偶联抗原最佳联接量的确定  40-41
    3.1.4 CAP单克隆抗体最佳工作浓度的确定  41
    3.1.5 检测微球数量的选择  41-42
    3.1.6 反应时间的选择  42
    3.1.7 标准曲线的建立  42-43
    3.1.8 ELISA竞争性检测CAP  43-45
  3.2 流式荧光微球技术检测克伦特罗  45-50
    3.2.1 盐酸克伦特罗偶联抗原合成与鉴定  45-46
    3.2.2 CL单克隆抗体与FITC的交联物的鉴定  46-47
    3.2.3 微球表面CL偶联抗原最佳联接量的确定  47-48
    3.2.4 单克隆抗体工作浓度的确定  48
    3.2.5 反应时间的选择  48-49
    3.2.6 标准曲线的建立  49
    3.2.7 ELISA竞争性检测CL  49-50
  3.3 流式荧光微球技术与ELISA方法比较  50
  3.4 流式荧光微球技术同步检测CL和CAP残留  50-52
    3.4.1 标准曲线的建立  50-51
    3.4.2 交叉反应性  51
    3.4.3 实际样品检测  51-52
第4章 讨论  52-54
结论  54-55
参考文献  55-60
附录一 流式微球一步法快速免疫检测马铃薯A病毒  60-67
附录二 攻读硕士期间发表的学术论文  67-68
致谢  68

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医药物学 > 兽医毒物学 > 动物性食品中化学物残留
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