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牛精液冷冻稀释液新配方研究
作 者: 蔡虹
导 师: 杨利国
学 校: 华中农业大学
专 业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 牛精液 冷冻保存 冷冻保护剂 抗冷休克物质 稀释液
分类号: S823
类 型: 硕士论文
年 份: 2009年
下 载: 85次
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内容摘要
本研究所用精液采自西门塔尔、夏洛莱、利木赞和安格斯各3头种公牛,通过改变牛精液冷冻保存液组成成分,检测了不同种公牛冷冻前后精子活力、顶体完整率及精子畸形率,从而了解不同个体和品种对精液冷冻效果的影响,并筛选出牛精液冷冻稀释液新配方,以提高牛精液冷冻保存的效果,提高人工授精受胎率。试验及主要结果如下:1、为了分析用大豆卵磷脂替代卵黄的精液冷冻保存效果,并筛选大豆卵磷脂最适浓度,分二个试验。①在牛冷冻精液稀释液国家标准推荐的配方基础上,添加1%、3%、5%、7%、9%的大豆卵磷脂替代卵黄。结果发现:当卵磷脂浓度为3%时,精液解冻后精子活率(为42.11±3.62%)显著高于对照组(冻后活力为38.334±2.45%,p<0.05)。卵磷脂浓度为5%时,解冻后活力为41.004±3.77%,仍高于对照组(p>0.05)。冻后各组精子顶体完整率和畸形率差异较小(p>0.05)。②以Tris-柠檬酸缓冲液为稀释液,添加1%、3%、5%、7%、9%的大豆卵磷脂替代卵黄,结果发现:当卵磷脂浓度为3%时,精液解冻后精子活力(39.56±3.40%)高于对照组(35.89±2.32%,p>0.05),而各组精子顶体完整率和畸形率没有显著差异(p>0.05)。因此,牛冷冻稀释液中添加3%和5%的卵磷脂冷冻效果较好。2、为了比较甘油(G)、乙二醇(EG)和二甲基酰胺(DA)三种抗冻保护剂两两配合的冷冻保护效果,分别设置了1%、3%、5%三个浓度两两正交组合,结果发现:5%G+3%EG、5%G+3%DA、3%EG+3%DA几个试验组效果较好,冻后活力分别为40.334±2.52%、38.674±1.15%、39.004±1.00%,均高于各自的对照组(p>0.05)。其中5%G+3%EG解冻后活力最高,精子顶体完整率也较高,畸形精子较少。3、为了比较甘油(G)、乙二醇(EG)和二甲基酰胺(DA)三种抗冻保护剂联合应用的冷冻保护效果,分别设置了1%、3%、5%三个浓度进行正交组合,结果发现:1%G+3%EG+3%DA组合冷冻效果最好(冻后活力达40.004±2.65%),高于对照组(p>0.05)。但解冻后顶体完整率在各试验组间,试验组和对照组间差异均不显著(p>0.05)。4、为了分析牛个体和品种对精子冷冻解冻的影响,分别取西门塔尔(XM)、利木赞(LM)和夏洛莱牛(XL)的精液进行冷冻,并检测了精子冷冻前后活力、冷冻后顶体完整率和精子畸形率。结果:XM、LM和XL鲜精活力无明显差异(p>0.05)。但是冷冻解冻后,XL精液冻后活力显著低于XM和LM(p<0.05),顶体完整率和畸形率差异不显著(p>0.05)。
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全文目录
摘要 9-11 Abstract 11-13 第一部分 牛精液冷冻保存技术研究进展 13-35 1 引言 13 2 国内外牛冷冻精液生产现状与发展趋势 13-15 2.1 国内外牛冷冻精液生产现状 13-14 2.1.1 冷冻方法 13 2.1.2 冷冻-解冻后精子活力 13-14 2.1.3 冷冻精液人工授精的受胎率 14 2.2 国内外牛冷冻精液发展趋势 14-15 3 精液稀释液成分研究进展 15-23 3.1 营养物质 16-17 3.2 缓冲物质 17-18 3.3 维持渗透压物质 18 3.4 防冷休克保护剂 18-20 3.5 抗冻保护剂 20-21 3.6 抗氧化物质 21-22 3.7 抗菌物质 22 3.8 其他添加物质 22-23 4 精液冷冻保存方法的研究进展 23-25 4.1 精液冷冻保存的冷源 23-24 4.2 冷冻程序 24 4.3 分装 24-25 5 冷冻过程中精子细胞的损伤变化 25-27 5.1 精液的成分变化 25 5.2 不同冷冻速度对精子的损伤 25-26 5.3 细胞膜损伤造成的精子损伤 26 5.4 精子形态的变化 26 5.5 精子细胞内成分的变化 26-27 6 影响精子冻后存活的因素 27-29 6.1 种属差异 27 6.2 冷冻精子的基因 27-28 6.3 冷冻前精子的质量 28 6.4 渗透性冷冻保护剂 28 6.5 精液稀释液 28 6.6 细胞内的Ca~(2+) 28-29 6.7 活性氧ROS 29 7 牛精液冷冻保存效果评定方法研究进展 29-35 7.1 评定指标和方法 29-33 7.1.1 外观检查法 29-30 7.1.2 精子活动能力评定 30 7.1.3 精子密度评定 30-31 7.1.4 精子畸形率和顶体完整率评定 31-32 7.1.5 精子存活时间和生存指数 32 7.1.6 精子细胞膜完整性的评价 32 7.1.7 精液中酶的活性 32-33 7.1.8 受精能力的检测 33 7.2 精液品质评定的新方法和新设备 33-35 7.2.1 精液品质分析仪 33 7.2.2 流式细胞计数仪分析精子染色体结构 33-34 7.2.3 流式细胞计数仪分析精子质膜变化 34 7.2.4 荧光极化各向异性测定精子质膜流动性 34-35 第二部分 试验研究 35-60 1 目的和意义 35-36 2 材料和方法 36-42 2.1 试验材料 36-38 2.1.1 试验动物 36 2.1.2 主要仪器和设备 36 2.1.3 主要药品及试剂 36-37 2.1.4 溶液配制 37-38 2.2 试验方法 38-40 2.2.1 精液采集 38 2.2.2 鲜精品质的评定 38 2.2.3 精液的稀释 38-39 2.2.4 平衡与分装 39 2.2.5 精液冷冻 39 2.2.6 冷冻精液的解冻 39 2.2.7 精液品质检查指标及方法 39-40 2.2.8 统计分析 40 2.3 试验设计 40-42 2.3.1 测定不同个体和品种牛的精液品质 40-41 2.3.2 采用大豆卵磷脂替代卵黄 41 2.3.3 甘油、乙二醇和二甲基酰胺混合试验 41-42 3 结果与分析 42-52 3.1 外观检查结果 42 3.2 pH检查 42-43 3.3 不同个体和品种牛的鲜精及解冻后精液品质的差异 43-44 3.4 卵磷脂替代卵黄 44-47 3.4.1 国标稀释液基础上卵磷脂替代卵黄 44-47 3.4.2 Tris-柠檬酸稀释液基础上卵磷脂替代卵黄 47 3.5 三种抗冻保护剂的不同组合替代纯甘油 47-52 3.5.1 甘油(G)和乙二醇(EG)组合 47-48 3.5.2 甘油(G)和二甲基酰胺(DA)组合 48-49 3.5.3 乙二醇(EG)和二甲基酰胺(DA)组合 49-50 3.5.4 G、EG、DA组合 50-52 4 讨论 52-58 4.1 精液的颜色和pH 52 4.2 大豆卵磷脂替代卵黄的效果 52-53 4.3 甘油、乙二醇和二甲基酰胺混合替代纯甘油冷冻的效果 53-54 4.3.1 甘油、乙二醇和二甲基酰胺两两组合的冷冻效果 53-54 4.3.2 甘油、乙二醇和二甲基酰胺三者组合的冷冻效果 54 4.4 牛的品种及个体差异和精液品质的关系 54-55 4.5 精液冷冻保存的几个技术问题 55-56 4.5.1 稀释液pH 55 4.5.2 稀释方法、温度 55 4.5.3 精液冷冻的平衡时间 55-56 4.6 稀释基础液中各种物质的选择 56-57 4.6.1 缓冲液的选择 56 4.6.2 糖类的选择 56-57 4.6.3 蒸馏水的使用 57 4.7 稀释液优化组合 57-58 5 小结 58-60 5.1 本研究获得的结果 58-59 5.2 本研究的创新点 59 5.3 本研究的不足之处 59 5.4 下一步值得研究的工作 59-60 参考文献 60-71 致谢 71
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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 牛
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