学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

樱桃谷鸭CD3ε胞外区多肽的原核表达、抗体制备及初步应用

作　者: 李卫
导　师: 胡薛英
学　校: 华中农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: DuCD3ε 序列分析鸭瘟病毒原核表达多克隆抗体
分类号: S858.32
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 46次
引　用: 3次
阅　读: 论文下载

内容摘要

本研究通过原核表达樱桃谷鸭CD3ε胞外区,制备兔抗鸭的CD3ε多克隆抗体,利用制备的抗体建立一种用于测定或分选出鸭的CD3~+T细胞亚群的方法,由于鸭瘟病毒主要侵害的是上皮细胞和淋巴细胞,运用此方法为阐明鸭瘟的致病机理提供依据,为以后进一步研究水禽疾病发生发展规律提供手段。根据GenBank中收录北京鸭CD3ε基因序列(AF378704)设计合成了特异性的引物,扩增了樱桃谷鸭和麻鸭CD3εORF基因,测定基因序列,将其登录到Genbank,其登录号分别为FJ524847和FJ524848。应用BLAST和DNASTAR等生物学软件比对分析表明:樱桃谷鸭、麻鸭、北京鸭间CD3ε基因ORF序列相互之间同源性都为99%。通过Clustalx(1.83)分析鸭的CD3ε基因ORF推导氨基酸序列差异,最保守的部位是ε链多肽的胞质区,而最不保守的是胞外区。根据樱桃谷鸭CD3ε序列,设计特异性的一对引物克隆胞外区。分别构建了DuCD3ε胞外区基因的原核表达质粒(pET-28a-DuCD3ε),并在E.coli BL21(DE3)中成功获得了表达,将纯化的重组蛋白作为免疫原,通过设计好的免疫程序,成功制备了兔抗重组蛋白的高免血清,通过间接ELISA测定兔抗rDuCD3ε抗体效价为1:51200。所得高免血清分别采用饱和硫酸铵粗提和Sephadex G-200过柱纯化,得到纯化的抗体。用鸭瘟病毒感染35日龄樱桃谷鸭,在感染后4d开始,感染鸭出现鸭瘟的特征性形态学变化,如病鸭头颈部肿大;剖检变化有肠道开始明显环状出血病理变化,同时在感染病毒后期的脾脏组织中,应用透射电镜观察到病毒粒子,证实鸭瘟的病理模型构建成功。在感染后1d、2d、3d、4d、5d、6d分别采取外周血液,制作血涂片检测。应用制备的兔抗樱桃谷鸭CD3ε多克隆抗体建立了检测鸭外周血中CD3阳性T淋巴细胞的免疫组织化学染色方法,具有较好的特异性。运用此方法对鸭瘟病毒感染后1d、2d、3d、4d、5d、6d鸭外周血液中CD3~+T淋巴细胞的检测表明,在感染病毒后3d内,外周血液中CD3~+T淋巴细胞数量逐渐增加;感染后3d,外周血液中CD3~+T淋巴细胞数量开始下降。另外在试验组中,通过光学显微镜观察到在感染后3d的脾脏、法氏囊和胸腺淋巴细胞都出现数量减少的现象,由此可以推测,在感染病毒后3d内外周血液中CD3~+T淋巴细胞数量增加可能是由于免疫器官中淋巴细胞迁移到外周血液中所致;3d后外周血液CD3~+T中淋巴细胞数量减少,可能是病毒导致总的淋巴细胞坏死所致。

樱桃谷鸭CD3ε胞外区多肽的原核表达、抗体制备及初步应用

内容摘要

全文目录

相似论文