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青岚湖五种淡水蚌的群体遗传多样性及三角帆蚌微卫星DNA的分离

作　者: 姬伟
导　师: 魏开建
学　校: 华中农业大学
专　业: 水产养殖
关键词: 淡水蚌 蚌科 微卫星DNA 遗传多样性 遗传变异 重组阳性克隆
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


利用北美Epioblasma capsaeformis和中欧Margaritifera margaritifera L．两种淡水双壳类的20对微卫星引物对江西青岚湖五种淡水蚌群体的基因组DNA进行了PCR扩增，筛选出8对多态性较高的引物，并用这8个微卫星座位分别对三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)、褶纹冠蚌(Cristaria plicata)、洞穴丽蚌(Lamprotula caveata)、射线裂脊蚌(Schistodesmus lampreyanus)和中国尖嵴蚌(Acuticosta chinensis)五种蚌类群体的等位基因频率、遗传杂合度、有效等位基因数、多态信息含量等进行了遗传多样性分析，根据标准遗传距离对这五种蚌进行了聚类分析。并进一步利用PCR法分离了三角帆蚌的微卫星标记。主要研究结果如下：1、五种蚌类群体的平均等位基因数为2.8750～4.000，平均观测杂合度(Ho)为0.4417～0.6333，平均期望杂合度(He)为0.4430～0.5706，平均多态信息含量(PIC)为0.368～0.498，五种蚌类群体表现出较高的遗传多样性。2、有多个座位在不同蚌类群体中偏离哈代—温伯格平衡。微卫星位点Ecap6和MarMa3116仅在射线裂脊蚌中扩增出单一条带，可以作为鉴定射线裂脊蚌的特异性微卫星标记。3、五种蚌类群体间的遗传距离在0.6228与1.4724之间，三角帆蚌和褶纹冠蚌之间的遗传距离最大，射线裂脊蚌和洞穴丽蚌之间的遗传距离最小。4、用PCR法从三角帆蚌基因组DNA中筛选微卫星切实可行，而且避免了同位素污染，一般实验室即可满足实验条件。5、运用PCR法在三角帆蚌的小片段基因组文库中能快速筛选含微卫星序列的重组阳性克隆，对筛选得到的31个阳性克隆进行测序，结果获得33个微卫星序列，其中perfect(完美型)25个，占75.8％；imperfect(非完美型)5个，占15.1％；compound(混合型)3个，占9.1％。对含微卫星的重组阳性克隆的测序结果表明，(AT／TC)_n在三角帆蚌的基因组DNA中含量比较丰富。

全文目录


摘要  8-9
ABSTRACT  9-11
缩略语表  11-12
第1章 文献综述  12-26
  1 淡水蚌概述  12-14
    1.1 淡水蚌的主要生物学特征  12
    1.2 鄱阳湖的淡水蚌  12-13
    1.3 淡水蚌的生物多样性  13
    1.4 淡水蚌研究现状  13-14
  2 遗传多样性的检测方法及其在水产研究中的应用  14-18
    2.1 形态学水平  14-15
    2.2 染色体(细胞学)水平  15
    2.3 同功酶水平  15
    2.4 DNA水平  15-18
      2.4.1 RFLP及其在水产研究中的应用  16
      2.4.2 RAPD及其在水产研究中的应用  16-17
      2.4.3 线粒体DNA及其在水产研究中的应用  17
      2.4.4 AFLP及其在水产研究中的应用  17
      2.4.5 SSR及其在水产研究中的应用  17-18
      2.4.6 单核苷酸多态性技术  18
  3 微卫星标记在水产动物中的应用前景  18-20
    3.1 群体遗传变异分析  18-19
    3.2 物种鉴定与亲缘关系研究  19
    3.3 系统发育和进化研究  19
    3.4 遗传图谱构建和基因定位  19-20
    3.5 辅助育种  20
    3.6 资源管理和保护  20
  4 微卫星位点的筛选  20-24
    4.1 从数据库中查找微卫星位点  21
    4.2 从相近物种获得微卫星引物  21
    4.3 从基因组DNA中筛选微卫星位点  21-24
      4.3.1 杂交法富集微卫星  22-23
      4.3.2 引物法富集微卫星  23
      4.3.3 PIMA法  23-24
  5 本研究的目的和意义  24-26
第2章 青岚湖五种淡水蚌群体的微卫星DNA分析  26-55
  1 材料和方法  26-34
    1.1 样本采集  26
    1.2 主要仪器及试剂  26-28
      1.2.1 主要仪器  26
      1.2.2 主要试剂  26-27
      1.2.3 溶液的配制  27-28
    1.3 基因组DNA的提取和检测  28-29
    1.4 微卫星引物的筛选及PCR反应体系的优化  29-31
      1.4.1 微卫星引物的来源  29
      1.4.2 微卫星引物的筛选  29-30
      1.4.3 PCR反应体系的优化  30-31
    1.5 微卫星多态扩增及扩增产物检测  31
    1.6 数据处理与分析  31-34
      1.6.1 等位基因频率  32
      1.6.2 遗传杂合度和平均遗传杂合度  32
      1.6.3 多态信息含量  32
      1.6.4 有效等位基因数  32-33
      1.6.5 Hardy-Weinberg平衡检验  33
      1.6.6 F-统计量  33
      1.6.7 遗传距离  33-34
      1.6.8 聚类分析  34
  2 结果与分析  34-48
    2.1 基因组DNA提取结果  34
    2.2 微卫星引物筛选结果  34-36
    2.3 PCR反应体系优化结果  36-37
      2.3.1 模板DNA浓度的优化结果  36
      2.3.2 dNTPs的优化结果  36
      2.3.3 引物浓度的优化结果  36-37
      2.3.4 Mg~(2+)浓度的优化结果  37
      2.3.5 Taq DNA聚合酶浓度的优化结果  37
      2.3.6 退火温度的优化  37
    2.4 8个微卫星位点PCR扩增结果  37-40
    2.5 五种蚌群体微卫星位点的多态性  40-48
      2.5.1 等位基因和基因频率  40-43
      2.5.2 各种群各位点的多态信息含量和杂和度  43-45
      2.5.3 各种群各位点的Hardy-Weinberg平衡检验  45-46
      2.5.4 微卫星位点的遗传分化  46-47
      2.5.5 各个种群间的遗传距离  47
      2.5.6 聚类分析  47-48
  3 讨论  48-53
    3.1 关于样本含量  48
    3.2 关于固定组织基因组DNA的提取  48
    3.3 影响PCR扩增及银染效果的主要因素  48-49
      3.3.1 影响PCR扩增的因素  48-49
      3.3.2 影响聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测效果的因素  49
    3.4 关于“影子带”的问题  49-50
    3.5 关于特异的微卫星位点  50
    3.6 关于种群内和种群间遗传变异  50-52
      3.6.1 等位基因和基因频率  50-51
      3.6.2 杂合度和多态信息含量  51-52
      3.6.3 Hardy-Weinberg平衡  52
      3.6.4 遗传距离和聚类分析  52
    3.7 微卫星在我国淡水蚌研究中的前景及对淡水蚌保护的建议  52-53
  4 小结  53-55
第3章 三角帆蚌微卫星DNA的分离  55-65
  1 材料和方法  55-59
    1.1 实验材料  55-56
      1.1.1 样本采集  55
      1.1.2 质粒和菌株  55-56
      1.1.3 引物  56
    1.2 实验仪器和药品  56-57
      1.2.1 实验仪器  56
      1.2.2 主要药品和试剂  56-57
      1.2.3 主要溶液的配制  57
    1.3 小片段基因组文库的构建  57-58
      1.3.1 基因组DNA的提取  57
      1.3.2 小片段基因组DNA的获得和纯化  57
      1.3.3 质粒DNA的提取和酶切  57-58
      1.3.4 连接  58
      1.3.5 转化  58
    1.4 PCR扩增筛选含有微卫星序列的阳性克隆  58
    1.5 含微卫星序列的阳性克隆DNA序列测定  58
    1.6 DNA序列分析  58-59
  2 实验结果  59-63
    2.1 三角帆蚌基因组DNA的提取结果  59
    2.2 三角帆蚌基因组DNA酶切结果  59
    2.3 质粒DNA提取和酶切结果  59-60
    2.4 PCR法筛选阳性克隆的结果  60-61
    2.5 DNA测序结果  61-63
  3 讨论  63-64
    3.1 微卫星标记分离方法的选择  63
    3.2 关于酶切基因组DNA的回收和纯化  63
    3.3 关于重组阳性克隆的PCR筛选  63
    3.4 关于三角帆蚌微卫星序列的类型  63-64
  4 小结  64-65
参考文献  65-73
致谢  73

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产基础科学 > 水产生物学 > 水产动物学
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