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小鼠辣椒素受体蛋白基因cDNA克隆及蛋白质表达

作　者: 易蓉
导　师: 张学文
学　校: 湖南农业大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 小鼠辣椒素受体蛋白 cDNA克隆蛋白表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

辣椒素受体(vanilloid receptor subtype 1),是一个配体门控的非选择性阳离子通道,是机体的一个重要的伤害性感受分子。深入研究VR1的生理特性,阐明其结构和功能的关系及在病理状态下的变化规律,对于理解疼痛的发生机制有极其重要的意义。本研究采用RT-PCR方法从小家鼠(Mus musculus)脊髓mRNA中克隆辣椒素受体蛋白VR1 cDNA全长序列以及配体结合位点约750bp的核心片段,构建VR1全长以及核心序列的大肠杆菌及酵母表达载体,分别实现了VR1原核表达以及真核表达。在原核细胞的表达中,选取了表达载体pET-32a、pMAL-p2X载体,分别构建了带T7启动子的融合表达载体pET-32a-VR1-F、pET-32a-VR1-C和带tac强启动子的辣椒素受体蛋白融合表达载体pMAL-p2X-VRl-C,并分别转入大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)和TBl中,实现了蛋白的诱导表达。在诱导表达过程中,研究了诱导温度、诱导时间、IPTG诱导浓度对蛋白表达的影响,并对表达后辣椒素受体蛋白生物学活性进行了分析,同时通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表达产物。结果表明,原核系统不适合进行辣椒素受体全长序列的蛋白质表达,但在其中可以有效表达辣椒素受体蛋白核心序列所编码的蛋白多肽。pET-32a和pMAL-p2X表达载体在VR1基因核心序列在蛋白表达量上没有明显差别。将辣椒素受体蛋白基因连接到酿酒酵母表达载体,构建重组质粒pVT102U/α-VR1,电转化入酿酒酵母(Saccharomyces serevisiae)S78菌株,筛选重组菌株S78-pVT102U/α-VR1,通过SDS-PAGE的方法初步分析表达产物,全长片段和核心片段的分子量分别约为94 KDa和29KDa,与天然辣椒素受体蛋白基本一致。

全文目录

中文摘要  6-7
Abstract  7-9
第一章文献综述  9-22
  1 辣椒素受体蛋白的研究概况  9-18
    1.1 辣椒素受体蛋白的结构  9-11
    1.2 辣椒素受体蛋白在体内的分布  11
    1.3 辣椒素受体蛋白的功能  11-13
    1.4 辣椒素受体蛋白的选择性竞争拮抗剂  13-14
    1.5 辣椒素受体蛋白的内源性配体  14-15
    1.6 TRP超家族(supper-family)和辣椒素受体蛋白相似蛋白  15-18
  2  18-21
    2.1 大肠杆菌表达系统  18
    2.2 大肠杆菌表达系统的表达载体  18-21
  3 真核表达系统  21
    3.1 用于基因表达的宿主菌-酵母表达系统  21
  4 本研究的目的  21-22
第二章辣椒素受体蛋白基因的克隆  22-34
  1 材料与试剂  22
    1.1 动物材料  22
    1.2 菌株  22
    1.3 酶与试剂盒  22
    1.4 试剂  22
  2 实验方法  22-27
    2.1 小鼠背脊段总RNA的提取  22-23
    2.2 用RT-PCR的方法获得辣椒素受体蛋白cDNA  23-27
  3 实验结果与分析  27-34
    3.1 小鼠总RNA提取  27
    3.2 辣椒素受体蛋白基因RT-PCR  27-28
    3.3 VR1基因序列分析  28-32
    3.4 讨论  32-34
第三章 VR1基因全长序列及核心序列原核pET-32a表达载体的构建及其表达  34-48
  1 材料与试剂  34-35
    1.1 菌株与质粒  34-35
    1.2工具酶及主要试剂  35
    1.3 试剂  35
  2 实验方法  35-40
    2.1 引物设计及VR1基因全长序列的PCR扩增  35-36
    2.2 全长融合表达载体pET-32a-VR1-F的构建及检测  36-39
    2.3 VR1基因核心序列融合表达载体pET-32a-VR1-C的构建及检测  39-40
  3 结果与分析  40-45
    3.1 全长表达载体pET-32a-VR1-F的构建及表达  40-42
    3.2 核心表达载体pET-32a-VR1-C的构建及表达  42-45
  4 讨论  45-48
    4.1 关于表达载体选择的讨论  45
    4.2 关于影响外源蛋白质表达因素的讨论  45-48
第四章 VRl基因核心序列原核pMAL-p2X表达载体的构建及其表达  48-57
  1 材料与试剂  48-49
    1.1 菌株与质粒  48-49
    1.2 工具酶及主要试剂  49
    1.3 试剂  49
  2 实验方法  49-52
    2.1 引物设计及VRl基因核心序列的PCR扩增  49-50
    2.2 核心融合表达载体pMa1-p2X-C的构建及检测  50-52
  3 结果与分析  52-55
    3.1 核心表达载体pMa1-p2X-VR1-C的构建及表达  52-55
  4 讨论  55-57
    4.1 关于pMa1-p2X表达载体  55-57
第五章 VR1基因全长序列及核心序列真核pVT102U/α表达载体的构建及其表达  57-70
  1 材料与试剂  57-58
    1.1 菌株与质粒  57
    1.2 工具酶及主要试剂  57-58
    1.3 真核表达培养基  58
  2 实验方法  58-62
    2.1 引物设计及VR1基因全长序列的PCR扩增  58-59
    2.2 全长融合表达载体pVT102U/α-F的构建及检测  59-61
    2.3 VRl基因核心序列融合表达载体pVT102U/α-VR1-C的构建及检测  61-62
  3 结果与分析  62-68
    3.1 全长表达载体pVT102U/α-VR1-F的构建及表达  62-65
    3.2 核心表达载体pVT102U/α-VR1-C的构建及表达  65-68
  4 讨论  68-70
第六章总结  70-71
参考文献  71-76
附录A:VR1基因全长序列测序报告  76-79
附录B:pET-32a-VR1-F表达载体测序报告  79-82
附录C:pVT102U/α-VR1-F表达载体测序报告  82-86
附录D:pVT102U/α-VR1-C表达载体测序报告  86-87
附录E:缩略词表  87-88
附录F:主要试剂配置  88-92
致谢  92-93
作者简介  93

小鼠辣椒素受体蛋白基因cDNA克隆及蛋白质表达

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