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感病番茄Rubisco小亚基和Lescpth5基因与Pseudomonas syringae pv.tomato互作的初步研究

作　者: 朱秀秀
导　师: 高必达；赵廷昌
学　校: 湖南农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 番茄细菌性斑点病 中蔬四号 酵母双杂交 rbcS/AvrPto/AvrPtoB Lescpth5
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


番茄细菌性斑点病是一种严重影响番茄质量和产量的世界性细菌病害,由丁香假单胞杆菌番茄致病变种Pseudomonas syringae pv.tomato(PST)引起。番茄中的抗病基因Pto与病原菌的无毒基因AvrPto互作是研究植物与病原物互作的典型模式系统,使植物抗病机理研究得到迅速的发展。但是感病番茄与病原物相互作用的机理研究的相对较少。冰核组实验室通过酵母双杂交系统发现毒性蛋白AvrPto/AvrPtoB在感病番茄中可能对核酮糖1,5-二磷酸加氧梭化酶小亚基(rbcS)起作用,并发现感细菌性斑点病的番茄“中蔬四号”中存在与Pto完全一致的序列Lescpth5。为明确rbcS是否是AvrPto/AvrPtoB在感病番茄中的毒性靶点,及Pto基因家族成员Lescpth5的与Pst的互作关系。本文:(1)提取中蔬四号RNA,合成第一链cDNA,提取Pst18的基因组DNA,根据已报道的rbcS、AvrPto和AvrPtoB的序列序列设计引物,扩增出其编码基因,分别将其克隆到酵母双杂交系统的诱饵载体和猎物载体上,利用酵母双杂交系统验证rbcS与AvrPto/AvrPtoB的互作关系。(2)提取中蔬四号RNA,合成第一链cDNA,根据已报道的Lescpth5序列设计引物,扩增出其编码基因,将其克隆到酵母双杂交系统的诱饵载体上;构建Pst18 cDNA文库,利用酵母双杂交系统筛选Lescpth5与Pst18互作基因。初步筛选结果显示结果显示:(1)pGBKT7-AvrPto与pGADT7-rbcS和pGBKT7-AvrPtoB与pGADT7-rbcS能够互作,但是互换载体后,共转化显示不互作。可能是由于某个蛋白不太适合应用于双杂交系统,也有可能是假阳性。(2)pGBKT7-Lescpth5基因对Pst18 cDNA文库筛选,得到阳性克隆在NCBI上进行Blast比对,其与pstDC3000酰基辅酶A脱氢酶家族蛋白同源性为97%,长度为215bp。酰基辅酶A脱氢酶家族蛋白与细菌能量代谢相关,在三羧酸循环起催化脱氢重要作用。推测Lescpth5基因虽然不能起到类似pto的抗病作用,但是可能对pstDC3000酰基辅酶A脱氢酶家族蛋白产生微弱的影响,通过影响细菌的脂多糖代谢阻止细菌在寄主体内大量繁殖。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-11
第一章 绪论  11-23
  1 番茄细菌性斑点病研究进展  11-19
    1.1 番茄细菌性斑点病及其病原菌简介  11-12
    1.2 植物防御反应机制  12-13
    1.3 Pto基因家族  13-14
      1.3.1 Pto基因  14
      1.3.2 Lescpth5基因  14
    1.4 番茄细菌性斑点病病原菌无毒基因AvrPto/AvrPtoB  14-17
      1.4.1 无毒基因AvrPto  15
      1.4.2 无毒基因AvrPtoB  15-17
    1.5 核酮糖1,5-二磷酸小亚基(rbcS)研究进展  17-18
    1.6 番茄细菌性斑点病原致病分子机制研究进展  18-19
  2 酵母双杂交系统  19-22
    2.1 酵母双杂交技术的原理  19-20
    2.2 酵母双杂交技术的应用  20-21
    2.3 酵母双杂交系统的优缺点  21-22
      2.3.1 酵母双杂交系统相对于其他技术的优点  21
      2.3.2 酵母双杂交系统中常见问题  21-22
  3 本论文研究的目的和意义  22-23
第二章 RBCS与AVRPTO/AVRPTOB之间的互作分析  23-48
  1 实验材料  23-25
    1.1 供试菌株  23
    1.2 供试植物  23
    1.3 培养基  23-24
    1.4 其他材料  24-25
  2 实验方法  25-41
    2.1 pGBKT7质粒载体的制备  25-27
      2.1.1 E.coli-pGBKT7质粒的复苏  25
      2.1.2 pGBKT7质粒的提取  25-26
      2.1.3 pGBKT7载体的酶切  26-27
      2.1.4 纯化酶切质粒  27
    2.2 pGADT7质粒载体的制备  27-29
      2.2.1 pGADT7质粒的连接及转化  27-28
      2.2.2 pGADT7质粒的提取  28
      2.2.3 pGADT7质粒的酶切鉴定  28
      2.2.4 pGADT7载体的酶切  28-29
      2.2.5 纯化酶切质粒  29
    2.3 Pst18基因AvrPto/AvrPtoB的克隆  29-32
      2.3.1 提取Pst18基因组DNA  29-30
      2.3.2 引物设计  30
      2.3.3 AvrPto/AvrPtoB基因的扩增  30-31
      2.3.4 PCR扩增产物回收  31-32
      2.3.5 目的片段酶切  32
    2.4 rbcS基因的克隆  32-35
      2.4.1 中蔬四号总RNA的提取  32-33
      2.4.2 RNA样品质量检测  33
      2.4.3 第一链cDNA的合成  33-34
      2.4.4 引物设计  34
      2.4.5 PCR反应  34
      2.4.6 PCR产物的回收纯化  34-35
      2.4.7 目的片段酶切  35
    2.5 重组质粒的构建  35-36
      2.5.1 外源基因和pGBKT7/pGADT7载体的连接  35
      2.5.2 连接产物的转化  35
      2.5.3 提取阳性克隆的质粒  35
      2.5.4 重组质粒的酶切鉴定  35-36
      2.5.5 测序鉴定  36
    2.6 检测融合蛋白的转录激活特性  36-39
      2.6.1 LiAc方法制备酵母感受态细胞  36-37
      2.6.2 纯化的质粒分别转化酵母菌株AH109  37-39
      2.6.3 DNA-BD融合蛋白对酵母细胞的毒性  39
    2.7 共转化验证rbcS与AvrPto/AvrPtoB之间的互作  39-41
      2.7.1 共转化rbcS与AvrPto/AvrPtoB  39-40
      2.7.2 对照  40-41
      2.7.3 再次共转化验证rbcS与AvrPto/AvrPtoB之间的互作  41
  3 结果与分析  41-46
    3.1 蛋白互作分析流程图  41
    3.2 AvrPto、AvrPtoB及rbcS基因的克隆  41-43
      3.2.1 基因组DNA提取结果  41-42
      3.2.2 中蔬四号总RNA的提取  42
      3.2.3 PCR扩增  42-43
    3.3 构建成功的诱饵载体酶切鉴定  43-44
    3.4 自激活和毒性检测结果  44
    3.5 载体插入片段的读码框验证  44-45
    3.6 共转化验证rbcS与AvrPto/AvrPtoB的互作  45-46
  4 小结和讨论  46-48
第三章 共转化筛选PST18DSCDNA与LESCPTH5互作的基因  48-68
  1 实验材料  48-51
  2 实验方法  51-61
    2.1 诱饵载体pGBKT7-Lescpth5的构建  51-52
      2.1.1 中蔬四号总RNA提取  51
      2.1.2 第一链cDNA合成  51
      2.1.3 引物设计  51
      2.1.4 PCR扩增  51-52
      2.1.5 PCR扩增产物回收  52
      2.1.6 目的片段Lescpth5酶切  52
      2.1.7 pGBKT7载体制备  52
      2.1.8 重组质粒的构建  52
      2.1.9 检测融合蛋白的转录激活特性  52
    2.2 构建Pst18的cDNA文库  52-55
      2.2.1 Trizol法提取Pst18总RNA  52-53
      2.2.2 RNA样品纯化  53
      2.2.3 RNA样品质量检测  53
      2.2.4 第一链cDNA的合成  53-54
      2.2.5 LD-PCR扩增双链cDNA  54-55
      2.2.6 dscDNA的浓缩  55
    2.3 共转化筛选和Lescpth5互作的基因  55-57
      2.3.1 LiAc方法制备酵母感受态细胞  55-56
      2.3.2 共转化方法筛选dscDNA中与Lescpth5互作的基因  56
      2.3.3 对照  56-57
      2.3.4 二次转化  57
    2.4 阳性克隆分析与鉴定  57-61
      2.4.1 阳性克隆β-半乳糖苷酶分析  57-58
      2.4.2 菌落PCR筛选阳性克隆  58
      2.4.3 酵母质粒的提取(液氮冻融法)  58-59
      2.4.4 电激感受态的制作  59
      2.4.5 电激转化  59
      2.4.6 质粒提取以及双酶切鉴定  59-60
      2.4.7 再次共转化验证  60
      2.4.8 β-半乳糖苷酶再次验证  60
      2.4.9 阳性克隆测序  60-61
  3 结果与分析  61-65
    3.1 诱饵载体pGBKT7--Lescpth5酶切鉴定  61
    3.2 自激活和毒性检测结果  61
    3.3 LD-PCR扩增dscDNA结果  61-62
      3.3.1 Pst18总RNA的提取  61-62
      3.3.2 LD-PCR扩增dscDNA  62
    3.4 共转化结果  62-63
    3.5 互作的阳性克隆分析  63
    3.6 菌落PCR的验证  63-64
    3.7 AD质粒酶切鉴定结果  64
    3.8 再次共转化验证  64-65
    3.9 测序结果与分析  65
  4 小结与讨论  65-68
第四章 结论与讨论  68-71
  1 结论  68
    1.1 利用酵母双杂交技术验证了rbcS与AvrPto/AvrPtoB之间互作可能是假阳性  68
    1.2 利用酵母双杂交技术筛选到与Lescpth5有微弱互作的蛋白  68
  2 讨论  68-69
  3 下一步研究设想  69-71
参考文献  71-76
英文缩略表  76-77
致谢  77

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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