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MES23.5细胞PKC对IRP1的调节作用研究

作　者: 王文杰
导　师: 王俊；谢俊霞
学　校: 青岛大学
专　业: 神经生物学
关键词: 帕金森病 PKC IRP1 6-OHDA 铁
分类号: R742.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 8次
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内容摘要

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一种多发于中老年的中枢神经系统退行性疾病,以运动不能、肌僵直、静止性震颤及姿势反射障碍为特征性表现,其病理学特征是黑质致密带多巴胺能神经元的脱失以及由此而导致的纹状体多巴胺的耗竭。但迄今为止,虽然遗传、环境和氧化应激等因素对PD发病可能均起到一定的作用,但其确切病因尚不完全清楚。目前大量的研究证实,黑质铁聚积参与了PD的发病。铁通过Fenton反应促进过氧化物的降解产生大量的羟自由基造成细胞的死亡；在PD动物模型中应用铁离子螯合剂可起到明显的神经保护作用。本实验室的前期研究表明,神经毒素6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)使黑质铁水平增加,铁的聚积造成了多巴胺能神经元的损伤；铁转出蛋白Ferroportin 1 (Fpn)的表达降低参与了PD黑质铁的聚积,而Fpnl的表达降低是由铁调节蛋白(iron responsive proteinl,IRP1)的激活(高表达)所致。IRP1受蛋白激酶C (protein kinase C, PKC)的调节,但此调节具有组织特异性,因此本研究拟探讨在多巴胺能神经元细胞系MES23.5细胞中IRP1是否受PKC的调节,若受此调节,那么6-OHDA能够激活PKC的哪些亚基以及是否通过激活这些亚基调控了IRP1进而实现其对细胞铁水平的调控。具体结果如下：1.0.01-2.0μmol/L PKC激动剂佛波醇酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)作用MES23.5细胞24h后,与对照组相比细胞存活率没有变化(F=3.050,p>0.05)2.0.2μmol/L PMA作用MES23.5细胞24h后,与对照组相比IRP1蛋白表达明显上调(p<0.01),2μmol/L PKC抑制剂双吲哚亚酰胺(Bisindolylmaleimide I Hydrochloride, BisI)作用MES23.5细胞24h后,与对照组(p<0.05)或PMA组(p<0.01)相比IRP1蛋白表达下调,0.2μmol/L PMA和2μmol/L BisI共同作用MES23.5细胞24h后,与对照组相比IRP1蛋白表达没有变化(p>0.05),与PMA组相比,IRP1蛋白表达明显降低(p<0.01)。3.0.2μmol/L PMA作用MES23.5细胞24h后,与对照组相比Fpnl蛋白表达下调(p<0.05),2μmol/L BisI作用MES23.5细胞24h后,与对照组(p<0.01)或PMA组(p<0.01)相比Fpnl蛋白表达明显上调,0.2μmol/L PMA和2μmol/L BisI共同作用MES23.5细胞24h后,与对照组相比Fpnl蛋白表达没有变化(p>0.05),与PMA组相比Fpnl的表达增加(p<0.05),与BisI组相比Fpnl的表达明显降低(p<0.01)。4.0.2μmol/L PMA作用MES23.5细胞24h后,与对照组相比铁转出功能降低(P<0.05),2μmol/L BisI作用MES23.5细胞24h后,与对照组或PMA组相比铁转出功能增强(p<0.01),0.2μmol/L PMA和2μmol/L BisI共同作用MES23.5细胞24h后,与对照组相比铁转出功能变化不明显(p>0.05),与BisI组相比,铁转出功能明显降低(p<0.01)。5.10μmol/L6-OHDA分别作用MES23.5细胞1h,3h,6h,12h,24h,与对照组相比PKCδ亚基磷酸化水平在1h处明显增加(p<0.05)。6.10μmol/L6-OHDA分别作用MES23.5细胞1h,3h,6h,12h,24h,与对照组相比PKCζ亚基磷酸化水平在6h和12h处明显增加(p<0.05)。7.10μmol/L6-OHDA分别作用MES23.5细胞1h,3h,6h,12h,24h,与对照组相比PKCε亚基磷酸化水平没有变化(p>0.05)。8.10μmol/L6-OHDA作用MES23.5细胞1h后,与对照组相比PKCδ亚基的磷酸化水平明显增加(p<0.05),预先用1μmol/L Rottlerin (PKCδ亚基抑制剂)作用MES23.5细胞1h后加10μmol/L6-OHbA继续作用1h,PKCδ亚基的磷酸化水平与6-OHDA组相比明显降低(p<0.05),与对照组相比差别无显著性(p>0.05),从而进一步证明PKCδ亚基能够被6-OHDA激活。9.10μmol/L6-OHDA作用MES23.5细胞6h后,与对照组相比PKCζ亚基的磷酸化水平明显增加(P<0.05),1μg/mL PKCζPseudo-substrate inhibitor作用MES23.5细胞1h后,与对照组和6-OHDA组相比PKCζ亚基的磷酸化水平明显降低(p<0.01),预先用1μg/mL PKCζPseudo-substrate inhibitor作用MES23.5细胞1h后加10μmol/L6-OHDA继续作用6h,PKCζ亚基的磷酸化水平与6-OHDA组相比明显降低(p<0.01),与1μg/mL PKCζPseudo-substrate inhibitor组相比明显增加(p<0.05),与对照组相比差别无显著性(p>0.05),从而进一步证明PKCζ亚基能够被6-OHDA激活。10.10μmol/L6-OHDA作用MES23.5细胞24h后,与对照组相比IRP1蛋白表达明显增加(p<0.01),1μmol/L Rottlerin作用MES23.5细胞24h后,与对照组相比IRP1蛋白表达下调(p<0.05),预先用1μmol/L Rottlerin作用MES23.5细胞1h后加10μmol/L6-OHDA继续作用24h,与对照组相比IRP1蛋白表达没有变化(p>0.05),与10μmol/L6-OHDA组相比,IRP1蛋白表达明显降低(p<0.01)。从而进一步证明6-OHDA能够通过激活PKCδ亚基使IRP1蛋白表达上调。11.10μmol/L6-OHDA作用MES23.5细胞24h后,与对照组相比IRP1蛋白表达明显上调(p<0.01),预先用1μg/mL PKCζPseudo-substrate inhibitor作用MES23.5细胞1h后加10μmol/L6-OHDA继续作用24h,IRP1蛋白表达与6-OHDA组相比明显降低(p<0.01),从而进一步证明6-OHDA能够通过激活PKCζ亚基使IRP1蛋白表达上调。上述结果表明在MES23.5细胞中PKC激动剂PMA能够激活IRP1,使其蛋白表达上调,IRP1激活引起了铁转出蛋白Fpnl蛋白表达降低,进而导致了细胞铁转出功能降低；而PKC抑制剂BisI使IRP1的表达降低,Fpnl蛋白表达增加,进而使细胞铁转出增强。由此说明在MES23.5细胞中PKC可以调节IRP1的功能。6-OHDA能激活PKC的δ亚基与ζ亚基,但不激活ε亚基；6-OHDA能够通过激活PKCδ和或PKCζ亚基使IRP 1蛋白表达上调,本研究使我们对PD黑质铁聚积的机制有一个更深入的认识,并且能为PD药物治疗提供有效的作用靶点。通过抑制PKC活性的药物调节IRP1蛋白表达来抑制黑质铁聚积,可能是帕金森病的一种新的治疗方式。

全文目录

摘要  2-5
Abstract  5-10
引言  10-12
材料和方法  12-20
  1. 细胞培养  12-13
  2. MTT方法检测细胞存活率  13
  3. PKC对IRP1和Fpn蛋白表达水平的影响  13-16
  4. PKC对铁转出功能的影响  16-17
  5. 6-OHDA对PKCδ,PKCζ,PKCε亚基磷酸化水平的影响  17-18
  6. PKCδ和PKCζ亚基对IRP1蛋白水平表达的影响  18-20
结果  20-32
  1. 0.01-2.0μM PMA对MES23.5细胞存活率没有影响  20
  2. PMA和BisⅠ分别引起IRP1蛋白表达增多和减少  20-22
  3. PMA和BisⅠ分别引起Fpn蛋白表达减少和增多  22-23
  4. PMA和BisⅠ分别引起铁转出功能降低和增强  23-24
  5. 6-OHDA使PKCδ亚基磷酸化水平增加  24-26
  6. 6-OHDA使PKCζ亚基磷酸化水平增加  26-28
  7. 6-OHDA对PKCε亚基磷酸化水平没有影响  28-29
  8. 6-OHDA通过激活PKCδ亚基引起IRP1蛋白表达增多  29-30
  9. 6-OHDA通过激活PKCζ亚基引起IRP1蛋白表达增多  30-32
讨论  32-36
结论  36-37
参考文献  37-40
综述  40-67
  参考文献  58-67
在学期间发表及待发表的文章  67
在学期间参加的学术会议及摘要  67
参与课题  67-68
缩略词表  68-70
致谢  70-71

MES23.5细胞PKC对IRP1的调节作用研究

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