学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

大肠杆菌HPI毒力岛irp1与irp2基因的研究

作　者: 董炳敏
导　师: 徐建生；成大荣
学　校: 扬州大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 高致病性毒力岛 irp1 irp2 同源重组
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 54次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

高致病性毒力岛(HPI)是耶尔森菌中一个35-45 kb的基因组,携带的基因与铁载体-耶尔森杆菌素合成、调节和转运有关。研究表明,HPI存在于多种肠道杆菌中,如大肠杆菌、沙门氏菌、克雷伯菌等,HPI可能是通过基因的水平转移在不同种属中分布。耶尔森菌的HPI有一个功能核心区,包括了11个基因,其中irp1和irp2为铁调节基因,仅在致病菌中表达,编码的两种高分子量蛋白HMWP1和HMWP2参与铁载体的合成,诱导鼠疫菌素受体和铁载体表达,与耶尔森菌的铁摄取能力有关。HPI不仅赋予病原体特殊的致病力,与感染过程有关,而且在细菌进化过程中扮演重要角色。本研究选择从江苏地区临床分离的HPI阳性大肠杆菌,根据已发表的基因序列,设计irp1与irp2基因的特异性引物,经PCR扩增获得目的片段后,插入到pUCm-T载体获得重组克隆pUCm-irp1、pUCm-irp2,经酶切鉴定,测序分析正确后回收目的片段,与表达载体pGEX-6p-1片段连接,获得重组质粒pGEX-irp1、pGEX-irp2,转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。重组菌在37℃经IPTG诱导表达后,裂解物经SDS-PAGE分析证明,含重组质粒pGEX-irp1和pGEX-irp2的重组菌能够表达分子量分别为41 kD和40 kD的融合蛋白GST-HMWP1和GST-HMWP2。可溶性蛋白经GSH-Sefinose纯化后纯度达95%以上,用纯化好的蛋白免疫新西兰兔,制备抗GST-HMWP1和GST-HMWP2血清,为进一步研究该蛋白的免疫学功能提供了条件。为深入研究irp1和irp2基因与HPI毒力岛的毒力相关性,本研究应用Red/ET同源重组技术对目的基因irp1、irp2进行了敲除。根据目的基因irp1、irp2和FRT-PGK-gb2-neo-FRT的序列设计一对引物扩增同源臂。第一步电转化将pRedET诱导表达质粒电转化入S793103和S711100的感受态细胞中,30℃培养；L-阿拉伯糖诱导Red/ET重组蛋白的表达,第二步电转化将扩增回收好的同源臂电转化入诱导后的感受态细胞中,ET重组体插入到功能区进入靶部位发生同源重组。

全文目录

中文摘要  3-4
英文摘要  4-6
目录  6-8
符号说明  8-9
综述  9-18
  1 高致病性毒力岛(HPI)概述  9-13
    1.1 高致病性毒力岛(HPI)的发现  9-10
    1.2 HPI的主要基因与功能  10-12
    1.3 HPI在肠杆菌科中的分布及致病性  12-13
  2 Red/ET重组系统及其应用  13-18
    2.1 Red/ET重组系统的结构及重组的作用机理  13-15
    2.2 Red/ET重组的主要应用方式  15-16
    2.3 Red/ET重组技术在生物科学领域的应用前景  16-18
研究一 HPI毒力岛irp1与irp2基因的克隆与表达  18-27
  摘要  18
  1 材料  18-19
    1.1 菌株和质粒  18
    1.2 工具酶与试剂  18-19
    1.3 培养基  19
  2 方法  19-23
    2.1 引物的设计与合成  19
    2.2 目的基因的扩增  19-21
    2.3 在pUCm-T载体中构建重组质粒pUCm-irp1与pUCm-irp2  21-22
    2.4 测序分析  22
    2.5 在pGEX-6p-1质粒中构建重组质粒pGEX-irp1与pGEX-irp2  22
    2.6 重组菌株的诱导表达及SDS-PAGE分析  22
    2.7 重组蛋白的纯化  22-23
  3 结果  23-25
    3.1 irp1与irp2片段的PCR扩增结果  23
    3.2 重组质粒pGEX-irp1和pGEX-irp2的酶切鉴定  23-24
    3.3 重组质粒转化菌经诱导后裂解物及纯化产物的SDS-PAGE  24-25
  4 讨论  25-27
研究二抗GST-HMWP1与抗GST-HMWP2抗体的制备  27-33
  摘要  27
  1 材料  27-28
    1.1 实验动物  27
    1.2 主要试剂  27-28
    1.3 主要仪器  28
    1.4 免疫原  28
  2 方法  28-29
    2.1 抗原乳化  28
    2.2 兔多抗的制备  28
    2.3 间接ELISA法检测抗体效价  28-29
    2.4 Western blot分析  29
  3 结果  29-31
    3.1 抗血清效价的测定  29-30
    3.2 多克隆抗体的Western blot检测  30-31
  4 讨论  31-33
研究三 HPI毒力岛irp1与irp2基因的敲除  33-43
  摘要  33
  1 材料  33-34
    1.1 菌株和质粒  33-34
    1.2 培养基  34
    1.3 仪器和试剂  34
  2 方法  34-38
    2.1 突变菌株的选择  34
    2.2 同源臂的扩增  34-36
    2.3 S793103、S711100菌株感受态细胞制备及pRedET表达质粒的转化  36-37
    2.4 携带pRedET表达质粒的感受态细胞制备及同源臂的转化  37-38
  3 结果  38-41
    3.1 突变细菌株选择结果  38-39
    3.2 同源臂的PCR扩增结果  39
    3.3 pRedET表达质粒电转化结果  39-40
    3.4 目的基因敲除验证  40-41
  4 讨论  41-43
结论  43-44
参考文献  44-49
致谢  49-50

大肠杆菌HPI毒力岛irp1与irp2基因的研究

内容摘要

全文目录

相似论文