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环孢素A-pH敏感性纳米粒的药代动力学研究

作　者: 房志刚
导　师: 张学农
学　校: 苏州大学
专　业: 药剂学
关键词: 环孢素A 纳米粒 药代动力学 HPLC–MS/MS 组织分布
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


目的本文制备环孢素A–pH敏感性纳米粒(cyclosporine A–loaded pH–sensitive nanoparticles,CyA–NP)及其冻干粉末(Freeze–dried CyA–NP,Fd–CyA–NP)二种剂型,建立高效液相色谱(HPLC)法和高效液相色谱–串联质谱(HPLC–MS/MS)法测定二种制剂的体内生物样品中CyA的药物浓度,旨在研究CyA–NP在体内的吸收、分布、代谢和排泄,为其进一步研究与开发提供科学依据。方法(1) CyA–NP和Fd–CyA–NP的制备及质量评价:应用乳化–溶剂扩散技术制备CyA–NP,通过真空冷冻干燥法制备其冻干粉末制剂。透射电镜观察纳米粒的表面形态;动态激光散射法测定平均粒径与粒度分布;HPLC法测定两种纳米粒制剂的包封率和载药量。(2)小鼠血液及各组织中CyA含量HPLC测定方法的建立及CyA–NP的组织分布及靶向性研究:以市售新山地明微乳制剂(Neoral)为参比制剂,小鼠单剂量灌胃给予两种制剂,采用液–液萃取法处理生物样品,环孢素D(cyclosporine D,CyD)为内标,HPLC法测定血液和各组织中药物浓度,以药动学参数(AUC, AUQ, Cmax, Tmax)和靶向参数(Te, RTe, TI)为评价指标。(3)犬血液中CyA含量HPLC测定方法的建立及Fd–CyA–NP的药代动力学研究:以双周期交叉随机试验设计法,六只家犬单剂量口服给予Fd–CyA–NP和Neoral,HPLC法测定CyA血药浓度,采用3P97软件计算药动学参数。(4)大鼠粪便及尿液中CyA含量HPLC–MS/MS测定方法的建立及CyA–NP的体内代谢研究:SD大鼠灌胃给予CyA–NP后,于不同时间段收集尿样及粪样,液–液萃取处理,正离子检测模式下,选择离子m/z1225→m/z1112(CyA)和m/z1239→m/z1099(CyD)进行多重反应检测(MRM),HPLC–MS/MS法测定样品中CyA含量,并根据代谢产物的相对分子质量及质谱行为,鉴定并阐述其结构。(5)大鼠肝微粒体中CyA含量HPLC测定方法的建立及CyA–NP的体外酶促动力学研究:差速离心法制备大鼠肝微粒体,Lowry法测定肝微粒体蛋白浓度,考察孵育时间、酶浓度和底物浓度对药物代谢速率的影响,并根据Lineweave–Brurk双倒数曲线,计算酶促动力学参数。结果(1) CyA–NP和Fd–CyA–NP的平均粒径分别为43.9±0.8 nm、52.7±4.6 nm。包封率均高达99%左右,载药量分别为(23.9±0.1)%、(22.9±0.2)%。纳米粒子均呈规则的圆球形。(2)小鼠血液及组织中CyA含量HPLC测定方法的回收率均大于72%,日内、日间精密度良好,该方法符合生物样品分析的要求。经3P97软件拟合,两种制剂在小鼠体内药代动力学均符合口服吸收二室模型,CyA–NP的相对生物利用度为162.5%,体内药物浓度分布趋势为肝脏>心脏>肾脏>脾脏>肺脏,与Neoral相比,有一定的肾脏和心脏趋向性,在肝脏中无蓄积。(3)犬血液中CyA含量HPLC测定方法的回收率均大于94%,日内、日间精密度均小于10%,该方法符合生物样品分析的要求。经3P97软件拟合,两种制剂的药代动力学过程均符合二室模型。与Neoral相比,Fd–CyA–NP的AUC显著增大(P<0.05),CL(s)显著降低(P<0.05),相对生物利用度为135.9%。(4)大鼠排泄物中CyA含量HPLC–MS/MS测定方法的回收率均大于80%,日内及日间精密度小于8%,准确度在±15%范围内。口服给药84 h后,在尿液及粪便中CyA累积排泄量分别为6.48±1.29μg、625.80±289.08μg,大鼠粪便中检测到甲基化、羟基化和二羟基化代谢产物共七种,而尿样中有六种。(5)大鼠肝微粒体中CyA含量HPLC测定方法的回收率大于87%,日内、日间精密度均小于10%,该方法符合生物样品分析的要求。肝内清除率(CLint)比较,原料药组要大于CyA–NP组(P<0.05),而最大反应速率(Vmax)和米氏常数(Km)无明显差异(P>0.05)。孵育90 min后,原料药组药物代谢率(1.049±0.028μg·mL–1)高于CyA–NP(0.874±0.023μg·mL–1) (P<0.05)。结论建立的生物样品中CyA含量HPLC和HPLC–MS/MS测定方法灵敏、简便、重现性好,适用于生物样品中CyA浓度检测及药代动力学研究。CyA–NP体内组织分布及代谢广泛,促进了药物口服吸收,显著提高了CyA的生物利用度。研究结果显示,这种新型pH敏感性纳米药物输送系统具有良好的开发应用前景。

全文目录


中文提要  4-6
Abstract  6-13
引言  13-20
  1. 血药浓度监测方法学研究进展  13-16
    1.1 HPLC 法  13-14
    1.2 HPLC–MS 法  14-15
    1.3 放射免疫法（RIA）  15
    1.4 荧光偏振免疫分析法（FPIA）  15-16
    1.5 高效毛细管电泳法（HPCE）  16
    1.6 受体结合法（RBA）  16
  2. CyA 纳米给药系统药动学研究进展  16-19
    2.1 吸收特性  17
    2.2 分布特性  17-18
    2.3 代谢特性  18
    2.4 毒性  18-19
  3. 确定本课题的主要考虑  19-20
第一章 环孢素A–pH 敏感性纳米粒的制备及质量评价  20-24
  仪器与试药  20
    一、仪器  20
    二、试药  20
  方法与结果  20-23
    一、环孢素A 纳米粒的制备  20-21
      1 CyA–NP 的制备  20-21
      2 Fd–CyA–NP 的制备  21
    二、纳米粒的质量评价  21-23
      1 粒径大小及分布  21-22
      2 包封率、载药量的测定  22
      3 电镜下的形态观察  22-23
  讨论与小结  23-24
第二章 CyA–NP 在小鼠体内的组织分布  24-38
  仪器与试药  24-25
    一、仪器  24
    二、试药  24-25
    三、实验动物  25
  方法与结果  25-36
    一、体内含量测定方法的建立  25-29
      1 色谱条件  25
      2 标准品储备液的配制  25
      3 生物样品的处理方法  25
      4 分析方法的专属性  25-26
      5 标准曲线  26-27
      6 回收率与精密度  27-29
    二、体内药代动力学研究  29-33
      1 溶液的配制  29
      2 给药与取样  29
      3 药物浓度–时间曲线  29-31
      4 CyA 在小鼠体内的模型拟合  31-32
      5 药代动力学参数  32-33
    三、组织分布研究  33-36
      1 组织分布  33-34
      2 靶向性评价  34-36
  讨论与小结  36-38
第三章 Fd–CyA–NP 在犬体内的药代动力学  38-47
  仪器与试药  38-39
    一、仪器  38
    二、试药  38
    三、实验动物  38-39
  方法与结果  39-45
    一、体内含量测定方法的建立  39-42
      1 色谱条件  39
      2 标准品储备液的配制  39
      3 全血样品的处理方法  39
      4 分析方法的专属性  39-40
      5 标准曲线  40-41
      6 回收率与精密度  41-42
    二、体内药代动力学研究  42-45
      1 给药与取样  42
      2 药物浓度–时间曲线  42
      3 CyA 在犬体内的模型拟合  42-44
      4 药代动力学参数  44-45
  讨论与小结  45-47
第四章 CyA–NP 在大鼠体内的排泄及代谢物研究  47-63
  仪器与试药  47-48
    一、仪器  47
    二、试药  47
    三、实验动物  47-48
  方法与结果  48-61
    一、体内含量测定方法的建立  48-55
      1 色谱与质谱条件  48
      2 标准品储备液的配制  48
      3 生物样品的处理方法  48-49
      4 标准品的质谱分析  49-50
      5 分析方法的专属性  50-52
      6 标准曲线  52-53
      7 回收率与精密度  53-55
    二、体内排泄及代谢物分析  55-61
      1 实验设计  55
      2 累积排泄率–时间曲线  55-56
      3 CyA 代谢物分析  56-59
      4 代谢途径分析  59-61
  讨论与小结  61-63
第五章 CyA–NP 在大鼠肝微粒体中的体外代谢研究  63-74
  仪器与试药  63-64
    一、仪器  63
    二、试药  63-64
    三、实验动物  64
  方法与结果  64-72
    一、大鼠肝微粒体的制备  64
    二、Lowry 法测定肝微粒体蛋白浓度  64-66
      1 溶液的配制  64-65
      2 检测波长的确定  65
      3 标准曲线  65
      4 回收率与精密度  65-66
      5 大鼠肝微粒体样品中蛋白浓度测定  66
    三、体内含量测定方法的建立  66-70
      1 色谱条件  66
      2 标准溶液的配制  66-67
      3 温孵条件  67
      4 生物样品的处理方法  67
      5 分析方法的专属性  67-68
      6 标准曲线  68-69
      7 回收率与精密度  69-70
    四、CyA 在大鼠肝微粒体中代谢的酶动力学  70-72
      1 温孵时间对CyA 代谢的影响  70-71
      2 肝微粒体蛋白浓度对CyA 代谢的影响  71
      3 底物浓度对CyA 代谢的影响  71-72
      4 酶促反应动力学参数  72
  讨论与小结  72-74
全文总结  74-76
  一、环孢素 A–pH 敏感性纳米粒的制备及质量评价  74
  二、CyA–NP 在小鼠体内的组织分布  74
  三、Fd–CyA–NP 在犬体内的药代动力学  74-75
  四、CyA–NP 排泄动力学及代谢物分析  75
  五、CyA–NP 在大鼠肝微粒体中的体外代谢研究  75-76
参考文献  76-82
攻读学位期间发表的论文与其它  82-83
致谢  83-84

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学
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