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鸡Mx基因表达及其抗体血清制备的研究

作　者: 田智泉
导　师: 李碧春
学　校: 扬州大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 鸡 Mx基因 表达 抗血清
分类号: S831
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 79次
引　用: 1次
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内容摘要


Mx蛋白在许多生物体内发现,具有广泛的抗病毒作用和GTP酶水解活性,是Ⅰ型干扰素诱导的蛋白,属于大分子GTP酶动态蛋白家族。该蛋白对多种负链RNA病毒有抑制作用。研究发现,不同物种及类型的Mx蛋白有不同的抗病毒特异性,并且其在抗病毒机理上也稍有不同。目前,对于该基因的表达、定位及其功能、作用机理的研究主要集中在人、小鼠等哺乳动物上,而对于家禽该基因的研究随着禽流感的爆发也日趋成为热点。本研究通过亚克隆鸡Mx基因,构建原核表达载体、真核表达载体,实现了该蛋白在不同体外条件下的表达及其抗体血清的制备,为鸡Mx蛋白的大量获取及其功能检测、作用机理研究奠定基础,同时也对家禽抗病基因的选择及抗病品种、转基因群体的制备提供重要的参考。主要研究结果如下:1.鸡抗病毒蛋Mx基因在大肠杆菌中的表达、纯化和鉴定。研究亚克隆鸡Mx基因cDNA序列,通过基因工程方法构建pET32a-Mx重组表达载体,并在工程菌Rossetta-gami (DE3)中诱导表达,并对诱导表达条件进行优化,以割胶纯化方法简捷获取纯化蛋白,Western blotting鉴定表达产物。研究结果显示:鸡Mx蛋白在37℃、0.8mmol/L IPTG浓度条件下诱导4小时时,在大肠杆菌中表达量最高。纯化和Western blotting鉴定结果显示,实现了鸡Mx蛋白在大肠杆菌中的融合、高效表达。2.鸡抗病毒蛋白Mx基因在毕赤酵母中的表达研究。研究将编码鸡抗病毒Mx蛋白基因亚克隆至含有分泌信号肽序列的穿梭表达载体中,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-Mx。用电转化法转化毕赤酵母菌株GS115后,筛选出高拷贝重组子。阳性菌株分别经0.5%、1%甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE检测。结果表明,成功构建了鸡抗病毒蛋白Mx基因穿梭表达载体,并筛选获得高拷贝菌株。表达产物经SDS-PAGE检测,结果显示,在甲醇浓度维持在1%时,鸡抗病毒Mx蛋白在毕赤酵母GS115中获得良好表达,并且外源基因表达蛋白约占上清蛋白总量的39.2%。3.鸡Mx基因组成型AAV-293细胞表达系的建立。本研究将鸡Mx基因克隆至pIRES2-EGFP载体,并引入6*His标签。鉴定正确后,将质粒pIRES2-EGFP-Mx转染AAV-293细胞,荧光倒置显微镜观察外源基因在细胞水平中的表达情况。并经RT-PCR,Western blotting等方法从RNA、蛋白质水平鉴定该蛋白在细胞中的表达。结果显示,目的基因实现了在AAV-293细胞中的表达,为稳定表达细胞系的建立奠定基础。4.基因免疫制备鸡Mx蛋白抗体血清的研究。采用基因免疫方法,将构建的真核表达载体pcDNA3.0-MMx用多聚乙酰亚胺(polyethylenimine,PEI)包裹后经肌肉途径免疫小鼠,连续免疫4次后,收集抗体血清,以间接免疫荧光(IFA)检测检测免疫血清抗体的效价,初步制备鸡Mx蛋白抗体血清。IFA结果显示:以1:50倍比稀释的血清能够特异性识别Mx蛋白;局部放大细胞IFA图片显示Mx蛋白呈颗粒状分布于细胞质中。

全文目录


中文摘要  4-6
ABSTRACT  6-13
引言  13
第一章 文献综述  13-24
  1 不同物种Mx 基因的发现及其命名  13-15
    1.1 Mx 基因的发现  13-14
    1.2 其他哺乳动物Mx 蛋白的发现  14-15
    1.3 鱼类Mx 蛋白的发现  15
    1.4 禽类Mx 基因的发现  15
  2 Mx 蛋白的结构  15-17
  3 Mx 蛋白的诱导表达调控机理  17-19
  4 Mx 蛋白的表达定位、功能  19-20
  5 Mx 蛋白的抗病毒机理  20-21
  6 Mx 基因多态性与抗病活性的关系  21-22
  7 Mx 基因在抗病育种中的研究展望  22-24
第二篇 试验研究  24-60
  实验一 鸡Mx 基因在E.coli 的表达、纯化及其鉴定  24-38
    1 材料和方法  24-31
      1.1 材料与试剂  24-26
      1.2 方法  26-31
    2 结果与分析  31-35
      2.1 基因克隆  31
      2.2 稀有密码子统计分析结果  31-32
      2.3 Mx 基因的T-A 克隆鉴定  32
      2.4 重组原核表达载体鉴定结果  32-33
      2.5 重组质粒外源蛋白的诱导表达  33
      2.6 表达条件的优化分析  33-35
      2.7 表达产物纯化和电泳鉴定  35
    3 讨论  35-38
      3.1 原核表达系统  35-36
      3.2 稀有密码子对外源基因在大肠杆菌中表达的影响  36-38
  实验二 鸡抗病毒蛋白 Mx 基因在毕赤酵母 GS115 中的表达  38-44
    1 材料和方法  38-40
      1.1 材料  38-39
      1.2 方法  39-40
    2 结果  40-43
      2.1 鸡抗病毒蛋白Mx 基因的克隆  40-41
      2.2 重组载体pMD-Mx 的构建与鉴定  41
      2.3 重组穿梭质粒pPIC9K-Mx 的构建与鉴定  41-42
      2.4 重组酵母菌株的筛选  42
      2.5 诱导表达产物的SDS-PAGE 检测  42-43
    3 讨论  43-44
   实验三 真核表达载体 pIRES2-EGFP-Mx 的构建及其在 293 细 胞内的表达研究  44-53
    1 材料和方法  44-48
      1.1 材料  44-45
      1.2 方法  45-48
    2 结果  48-51
      2.1 目的基因的克隆  48
      2.2 pIRES2-EGFP-Mx 的构建鉴定结果  48-49
      2.3 多聚乙烯亚胺介导质粒对293 细胞的瞬时转染  49-50
      2.4 目的基因在293 细胞中的表达检测  50-51
    3 讨论  51-53
  实验四 基因免疫制备鸡 Mx 基因抗体血清及其初步应用  53-60
    1 材料和方法  53-56
      1.1 材料  53-54
      1.2 方法  54-55
      1.3 细胞转染  55
      1.4 转染pcDNA3.0-MMx 后NIH-3T3 的筛选  55
      1.5 RT-PCR 检测Mx 的表达  55-56
      1.6 IFA 检测抗体血清  56
    2 结果  56-58
      2.1 真核表达载体的鉴定结果  56
      2.2 RT-PCR 检测Mx 蛋白在3T3 细胞中的表达  56-57
      2.3 IFA 检测抗血清效价  57-58
    3 讨论  58-60
全文结论  60-61
参考文献  61-69
致谢  69-70
硕士期间发表的论文  70

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家禽 > 鸡
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