学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

PPRV N蛋白在杆状病毒中的克隆表达及PPR免疫学检测方法的建立

作　者: 李伟
导　师: 李刚
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: PPRV 杆状病毒 间接ELISA 单克隆抗体 cELISA
分类号: S854.43
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 100次
引　用: 1次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


小反刍兽疫是一种危害严重的小反刍兽传染病,近年来成蔓延趋势,且流行趋势日趋严峻。2007年7月我国西藏地区首次发生小反刍兽疫疫情,加强对小反当兽疫的病原学、流行病学、诊断方法和预防措施等方面的综合性研究显得十分紧迫和必要。本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒-昆虫表达系统,构建含有小反刍兽疫病毒( PPRV) N基因的重组杆状病毒。首先构建含有PPRV N基因的转移载体pFastBacTM HTA-N,转化E.coli DH10Bac感受态菌。之后利用其含有的细菌Tn7转座系统,将该基因重组至杆状病毒穿梭质粒bacmid中,转染昆虫细胞Sf21,获得含有PPRV N基因的重组杆状病毒。PCR鉴定含PPRV N基因的重组杆状病毒构建成功,感染昆虫细胞后,SDS-PAGE鉴定出60ku左右的蛋白表达。Western blotting检测出该蛋白具有很好的抗原性。利用杆状病毒表达系统,成功地构建了含Bacmid-PPRV-N基因的重组杆状病毒,并以重组Bacmid-PPRV-N蛋白做抗原,建立了间接ELISA检测方法。检测来自西藏疫区的37份山羊血清和来自青海省非疫区的92份山羊血清,与法国蒙彼利埃农学发展研究国际合作中心( CIRAD-EMVT)提供的竞争ELISA试剂盒相比较特异性为100%,敏感性为96.2%,二者的符合率达到96.9%。以纯化的Bacmid-PPRV-N重组蛋白作为免疫原免疫Balb/c小鼠,采集免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。使用原核表达pET-32a-PPRV-N蛋白做ELISA检测抗原,通过有限稀释法进行3次亚克隆,共筛选得到8株稳定分泌抗PPRV-N蛋白的单克隆抗体。采用体内诱生腹水法大量制备单克隆抗体。其中1D5杂交瘤细胞上清单抗效价为1∶16000,小鼠单抗腹水效价达到1∶106,分泌单抗亚类为IgG2b。单抗具有良好的特异性和稳定性。以纯化的Bacmid-PPRV-N作为包被抗原,以1D5单抗作为竞争抗体,建立了检测PPR血清抗体的单抗竞争性ELISA检测方法,该方法具有较高的灵敏度和特异性。选取的1D5单抗能够特异性的区分RP阳性血清和PPR阳性血清。应用建立的单抗竞争性ELISA检测方法检测疫区的187份血清样本,与标准竞争ELISA试剂盒的符合率为98.9%。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-18
第一章 绪论  18-24
  1.1 研究目的和意义  18
  1.2 研究内容和方法  18-20
    1.2.1 重组杆状病毒的构建  18-19
    1.2.2 间接ELISA 血清抗体检测方法的建立和应用  19
    1.2.3 抗PPRV-N 蛋白单克隆抗体的制备及鉴定  19
    1.2.4 单抗竞争性ELISA 方法的建立和应用  19-20
  1.3 小反刍兽疫的研究进展  20-22
    1.3.1 小反刍兽疫病毒的病原学  20
    1.3.2 小反刍兽疫的流行病学  20-21
    1.3.3 小反刍兽疫的诊断及预防  21-22
  1.4 杆状病毒昆虫表达系统研究进展  22-24
    1.4.1 杆状病毒的生物学特性  22-23
    1.4.2 杆状病毒转移载体的发展  23
    1.4.3 杆状病毒-昆虫表达系统的应用  23-24
第二章 小反刍兽疫病毒N 蛋白在杆状病毒中的克隆表达  24-42
  2.1 试验材料  24-29
    2.1.1 菌株、细胞株和质粒  24
    2.1.2 主要试剂  24-25
    2.1.3 试验所用溶液  25-29
    2.1.4 主要仪器设备  29
  2.2 试验方法  29-36
    2.2.1 目的基因的扩增  29-30
    2.2.2 重组供体质粒pFastBacTM HTA-N 的构建  30-31
    2.2.3 重组供体质粒在细菌内的转座反应 -转化 DH10Bac  31
    2.2.4 重组bacmid DNA 的提取  31-32
    2.2.5 重组bacmid DNA 的鉴定  32-33
    2.2.6 重组bacmid 转染Sf21 细胞  33-34
    2.2.7 分离 P1 代种毒  34-35
    2.2.8 扩增 P1 代种毒  35-36
    2.2.9 重组病毒的 SDS-PAGE 鉴定  36
    2.2.10 Western blot 鉴定重组蛋白的抗原性  36
  2.3 试验结果  36-40
    2.3.1 重组供体质粒pFastBacTM HTA-N 的鉴定  36-37
    2.3.2 重组 Bacmid-PPRV-N 质粒的 PCR 鉴定  37
    2.3.3 重组质粒转染 Sf21 后的细胞形态  37-38
    2.3.4 重组病毒的 SDS-PAGE 鉴定  38-39
    2.3.5 Western blot 鉴定重组蛋白的抗原性  39-40
  2.4 讨论  40-42
第三章 小反刍兽疫病毒重组 N 蛋白间接ELISA 方法的建立  42-53
  3.1 试验材料  42-44
    3.1.1 病毒和血清  42
    3.1.2 主要试剂和器材  42-43
    3.1.3 试验所用溶液  43-44
  3.2 试验方法  44-46
    3.2.1 Bacmid-PPRV-N 重组蛋白的表达  44
    3.2.2 Bacmid-PPRV-N 重组蛋白的纯化  44
    3.2.3 Bacmid-PPRV-N 重组蛋白间接ELISA 方法的操作步骤  44-45
    3.2.4 抗原包被浓度和血清稀释度的确定  45
    3.2.5 最佳封闭试剂及最佳封闭时间的选择  45
    3.2.6 血清作用时间的确定  45
    3.2.7 酶标二抗稀释度及作用时间的确定  45
    3.2.8 最佳显色时间的确定  45
    3.2.9 cutoff 值及阴阳性标准的确定  45-46
    3.2.10 批内、批间重复性评价  46
    3.2.11 间接ELISA 检测方法的特异性评价  46
    3.2.12 临床检测的符合率试验  46
  3.3 试验结果  46-51
    3.3.1 Bacmid-PPRV-N 重组蛋白的纯化  46-47
    3.3.2 抗原包被浓度和血清稀释度的确定  47
    3.3.3 最佳封闭试剂及最佳封闭时间的选择  47-48
    3.3.4 血清作用时间确定  48
    3.3.5 酶标二抗稀释度及作用时间的确定  48-49
    3.3.6 最佳显色时间的确定  49
    3.3.7 cutoff 值及阴阳性标准的确定  49
    3.3.8 批内、批间重复性的评价  49-50
    3.3.9 间接ELISA 特异性试验  50-51
    3.3.10 临床检测的符合率试验  51
  3.4 讨论  51-53
第四章 小反刍兽疫病毒 N 蛋白单克隆抗体的制备  53-68
  4.1 试验材料  53-55
    4.1.1 主要试剂  53-54
    4.1.2 菌株、细胞及实验动物  54
    4.1.3 主要仪器及耗材  54
    4.1.4 主要溶液的配制  54-55
  4.2 试验方法  55-61
    4.2.1 纯化抗原免疫小鼠  55
    4.2.2 小鼠免疫血清效价的测定（间接ELISA 方法）  55-56
    4.2.3 饲养细胞的制备  56-57
    4.2.4 SP2/0 骨髓瘤细胞的准备  57
    4.2.5 脾淋巴细胞悬液的准备  57
    4.2.6 脾淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合  57-58
    4.2.7 筛选抗原的准备  58
    4.2.8 阳性杂交瘤细胞株的筛选  58
    4.2.9 阳性孔的亚克隆  58-59
    4.2.10 杂交瘤细胞的冻存与复苏  59
    4.2.11 单克隆抗体亚类的鉴定  59
    4.2.12 单克隆抗体的大量制备  59
    4.2.13 单克隆抗体的Western blot 鉴定  59-60
    4.2.14 单克隆抗体1D5 的免疫荧光试验  60
    4.2.15 单克隆抗体腹水效价的测定  60
    4.2.16 单克隆抗体亲和力测定  60-61
    4.2.17 单克隆抗体特异性测定  61
    4.2.18 杂交瘤细胞的稳定性  61
  4.3 试验结果  61-66
    4.3.1 小鼠免疫血清效价的测定  61-62
    4.3.2 细胞融合率计算  62
    4.3.3 杂交瘤细胞阳性克隆率计算  62
    4.3.4 单克隆抗体的亚类鉴定  62
    4.3.5 单克隆抗体的Western blot 鉴定  62-63
    4.3.6 单克隆抗体1D5 的免疫荧光试验  63-64
    4.3.7 单克隆抗体腹水效价的测定  64
    4.3.8 单克隆抗体亲和力测定  64-65
    4.3.9 单抗特异性测定  65-66
    4.3.10 杂交瘤细胞的稳定性  66
  4.4 讨论  66-68
第五章 小反刍兽疫单抗竞争性 ELISA 检测方法的建立  68-75
  5.1 试验材料  68
  5.2 试验方法  68-70
    5.2.1 竞争 ELISA 的原理  68
    5.2.2 Bacmid-PPRV-N 最佳包被浓度和单抗最佳稀释度的确定  68-69
    5.2.3 Bacmid-PPRV-N 蛋白包被方式的确定  69
    5.2.4 最佳封闭方式的确定  69
    5.2.5 山羊抗小鼠IgG-HRP 最佳工作浓度的确定  69
    5.2.6 最佳显色时间的确定  69
    5.2.7 竞争ELISA 操作程序  69
    5.2.8 待检血清稀释度的确定  69
    5.2.9 单抗竞争性ELISA 的特异性评价  69-70
    5.2.10 单抗竞争性ELISA 的稳定性  70
    5.2.11 单抗竞争性ELISA 的应用  70
  5.3 试验结果  70-74
    5.3.1 Bacmid-PPRV-N 最佳包被浓度和单抗最佳稀释度的确定  70-71
    5.3.2 Bacmid-PPRV-N 蛋白包被方式的确定  71
    5.3.3 最佳封闭方式的确定  71
    5.3.4 山羊抗小鼠IgG-HRP 最佳工作浓度的确定  71-72
    5.3.5 最佳显色时间的确定  72
    5.3.6 待检血清稀释度的确定  72
    5.3.8 单抗竞争性ELISA 的特异性评价  72-73
    5.3.9 单抗竞争性ELISA 的稳定性  73
    5.3.10 单抗竞争性ELISA 方法的应用  73-74
  5.4 讨论  74-75
第六章 总结  75-77
  6.1 结论  75
  6.2 本研究的下一步设想  75-77
参考文献  77-82
致谢  82-83
作者简历  83

相似论文

  1. 抗吡虫啉—甲基对硫磷双特异性单克隆抗体的研究,S482.2
  2. 磷酸化介导的UGT1A3代谢活性差异的初步研究,R346
  3. 企鹅珍珠贝Cd-MT酶联免疫检测方法的建立及试剂盒的初步研制,X835
  4. 甲型流感病毒M2蛋白的表达、纯化及其免疫原性的研究,R392
  5. STLV-1病毒间接ELISA方法建立及杂交瘤细胞株的筛选,R373
  6. 鸭源鸡杆菌抗体消长规律研究及抗脂多糖单抗杂交瘤细胞株的建立,S858.32
  7. 稳定分泌抗羊种布鲁菌脂多糖单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立,R392
  8. 传染性法氏囊病病毒VP2基因的表达与单克隆抗体的制备,S852.65
  9. 犬细小病毒2型VP2基因在昆虫细胞中的表达及血清抗体间接ELISA检测方法的建立,S852.65
  10. 猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备与鉴定,S852.65
  11. 华东地区鸭圆环病毒感染流行病学调查及其单克隆抗体的制备,S858.32
  12. 猪流感病毒NS1蛋白间接ELISA检测方法的建立及NS、NP蛋白细胞定位研究,S858.28
  13. 猪TNF-α单克隆抗体制备与PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞TNF-α变化规律研究,S858.28
  14. J亚型禽白血病病毒抗体检测方法的建立及LTR体外启动活性分析,S858.31
  15. 日本血吸虫重组蛋白rSjGST的表达纯化及单克隆抗体的制备和特性鉴定,R392
  16. 应用Bac-to-Bac杆状病毒表达体系在sf9细胞中重组表达保守性多巴胺能神经营养因子,R346
  17. 兔源支气管败血波氏杆菌PRN蛋白的表达及其免疫保护性研究,S855.12
  18. 乙型脑炎病毒单克隆抗体的制备与初步应用,R392
  19. 鼠抗人PD-L1功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的研究,R392
  20. 1.tmTNF-α通过TNFR2诱导凋亡的信号途径 2.抗体的制备及鉴定,R392
  21. 猪圆环病毒Ⅱ型核酸疫苗的构建及间接ELISA方法的建立,S858.28

中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医临床医学 > 兽医诊断学 > 实验室诊断法
© 2012 www.xueweilunwen.com