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猪肠粘膜硫酸皮肤素提取、纯化及抗凝性研究

作　者: 向琼
导　师: 李宗军
学　校: 湖南农业大学
专　业: 营养与食品卫生学
关键词: 猪肠粘膜硫酸皮肤素提取纯化抗凝性
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

硫酸皮肤素是一种硫酸化的糖胺聚糖,在许多生理、病理学过程中均起着重要作用。猪小肠是商品硫酸皮肤素的重要来源,本课题主要研究从猪小肠粘膜中酶法提取硫酸皮肤素,并以大孔树脂对其进一步纯化方法进行研究。结果如下：1、酶法提取硫酸皮肤素工艺优化使用protamex蛋白酶水解提取猪小肠粘膜中的硫酸皮肤素,以酶解时间、酶解温度、加酶量、pH为影响硫酸皮肤素提取率的因素,以硫酸皮肤素粗品得率为评价指标,进行正交试验来确定较优的硫酸皮肤素提取的条件,得到最终优化条件为,50ml粘膜稀释液加热至55℃,调解pH为7.5,加入0.9g protamex蛋白酶,恒温、低速搅拌下酶解7.5h,再以2体积无水乙醇沉淀硫酸皮肤素。2、树脂纯化硫酸皮肤素工艺优化通过静态树脂筛选试验,从BS-Ⅱ型、D208型、D254型、D204型、D241型五种不同大孔树脂中,确定D208型大孔树脂为理想的适用于硫酸皮肤素纯化的树脂。通过D208型大孔树脂的静态吸附及解析试验得到,最佳静态吸附解析条件：配置DS样液初始浓度为0.15mg/ml,取100ml配置好的样液,调解pH至9.0,加入10g准确称取的D208树脂,于在55。C的摇床中以200r/min的振荡速度吸附7h可达到最优吸附率。吸附完成后,用体积分数为95%的乙醇对树脂解析。通过D208型大孔树脂的动态吸附及解析试验,研究了纯化硫酸皮肤素的最佳上样样液浓度、上样流速、洗脱液流速,得到纯化硫酸皮肤素的最优条件：称取5g已预处理的D208型树脂用湿法装柱,以浓度为1.0mg/ml的硫酸皮肤素样品液上柱,以1.0ml/min的流速进行动态吸附；吸附结束后,先用蒸馏水淋洗吸附柱,再用95%的乙醇溶液,以1.0ml/min勺流速解析。最后冻干得到纯化后的硫酸皮肤素,纯度为73.96%,蛋白浓度为0.84%。3、猪肠硫酸皮肤素体外抗凝血体外抗凝试验以肝素作对照,研究猪肠粘膜硫酸皮肤素对凝血时间及凝血酶原时间的影响。结果表明猪肠粘膜硫酸皮肤素对凝血时间的影响较大,而对凝血酶原时间的影响不显著,说明其凝血机制主要是作用于内源性凝血途径,而肝素对CT和PT的影响均很显著,其凝血机制与DS是不同的

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-11
第一章绪论  11-21
  1 概述  11
  2 硫酸皮肤素提取纯化研究  11-14
    2.1 硫酸皮肤素提取研究  11-13
    2.2 硫酸皮肤素纯化研究  13-14
  3 硫酸皮肤素测定研究  14-16
    3.1 电泳法  14
    3.2 高效液相色谱法  14-15
    3.3 分光光度法  15
    3.4 共振瑞利散射法测定  15-16
    3.5 其它方法  16
  4 硫酸皮肤素生物学活性概述  16-19
    4.1 硫酸皮肤素与血栓  16-17
    4.2 硫酸皮肤素与炎症  17-18
    4.3 硫酸皮肤素与感染  18
    4.4 硫酸皮肤素与肿瘤  18
    4.5 硫酸皮肤素的损伤修复作用  18-19
  5 课题的目的、意义及研究内容  19-21
    5.1 选题目的及意义  19
    5.2 研究内容及思路  19-21
      5.2.1 猪肠粘膜硫酸皮肤素的提取研究  19-20
      5.2.2 猪肠粘膜硫酸皮肤素的纯化研究  20
      5.2.3 猪肠粘膜硫酸皮肤素的体外抗凝活性研究  20-21
第二章猪小肠粘膜硫酸皮肤素的提取研究  21-34
  1 材料与方法  21-24
    1.1 试剂与仪器  21-22
    1.2 材料  22
    1.3 提取工艺流程  22
    1.4 测定方法[71]及得率计算  22-23
    1.5 提取工艺优化  23-24
  2 结果与分析  24-32
    2.1 硫酸皮胀素标准曲线绘制  24-25
    2.2 单因素试验  25-30
    2.3 正交试验  30-31
    2.4 不同沉淀剂体积选择  31-32
  3 本章小结  32-34
第三章猪小肠粘膜硫酸皮肤素的分离纯化  34-56
  1 实验材料  34-35
    1.1 试剂  34
    1.2 仪器设备  34-35
  2 实验方法  35-39
    2.1 树脂预处理  35
    2.2 树脂筛选  35-36
      2.2.1 硫酸皮肤素样液制备  35
      2.2.2 吸附试验  35-36
      2.2.3 解析试验  36
    2.3 D208树脂静态吸附及解析研究  36-38
      2.3.1 吸附单因素试验  36
      2.3.2 正交试验  36-37
      2.3.3 吸附等温线  37
      2.3.4 吸附动力学曲线  37
      2.3.5 解析液的筛选  37
      2.3.6 醇体积分数的确定  37-38
    2.4 树脂动态吸附及解析  38
      2.4.1 上样流速对D208树脂动态吸附性能的影响  38
      2.4.2 样液浓度对D208树脂动态吸附性能的影响  38
      2.4.3 洗脱流速对对D208树脂解析性能的影响  38
    2.5 树脂再生性能研究  38
    2.6 产品纯度计算方法  38-39
  3 结果与分析  39-55
    3.1 吸附树脂筛选  39-42
      3.1.1 静态吸附及解析试验结果  39-41
      3.1.2 动态解析筛选  41-42
    3.2 D208树脂对DS静态吸附解析性能研究  42-51
      3.2.1 静态吸附中温度对吸附率的影响  42-43
      3.2.2 静态吸附中pH对吸附率的影响  43-44
      3.2.3 静态吸附中振荡速度对吸附率的影响  44-45
      3.2.4 样液浓度对静态吸附吸附率的影响  45-46
      3.2.5 正交试验  46-47
      3.2.6 吸附等温线  47-48
      3.2.7 吸附动力学曲线  48-50
      3.2.8 洗脱液的选择  50
      3.2.9 乙醇体积分数的确定  50-51
    3.3 树脂动态吸附及解析研究  51-54
      3.3.1 不同上样流速的动态吸附曲线  51-53
      3.3.2 不同上样浓度的动态吸附曲线  53
      3.3.3 洗脱流速的确定  53-54
    3.4 树脂再生  54-55
  4 本章小结  55-56
第四章抗凝血试验  56-60
  1 材料  56
    1.1 样品与试剂  56
    1.2 仪器  56
  2 方法  56-57
    2.1 凝血时间测定  56-57
      2.1.1 基本原理  56-57
      2.1.2 实验方法  57
    2.2 血浆凝血酶原时间测定  57
      2.2.1 基本原理  57
      2.2.2 实验方法  57
  3 结果与讨论  57-59
  4 本章小结  59-60
第五章总结与展望  60-62
  1 总结  60
  2 本论文创新点  60
  3 展望  60-62
参考文献  62-67
致谢  67-68
作者简介  68

猪肠粘膜硫酸皮肤素提取、纯化及抗凝性研究

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