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去甲斑蝥素对人肝癌SMMC-7721细胞迁移、侵袭的影响

作　者: 李晓鹏
导　师: 崔东来
学　校: 河北医科大学
专　业: 内科学
关键词: 肝癌SMMC-7721细胞去甲斑蝥素迁移侵袭 MMP-2 TIMP-2
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一种很常见的肿瘤，也是恶性程度非常高的肿瘤，已成为全世界癌症死亡的第三大原因，仅次于肺癌和胃癌，对人类健康威胁极大。影响肝癌预后的主要因素是复发和转移。虽然对肝癌的治疗仍以手术切除为首选，但大部分患者确诊时已发生临床或显微镜下转移，使肝癌的预后仍然很差。肝癌极高的转移复发率是提高患者生存率的主要障碍，肿瘤的局部浸润和远处转移是肝癌病人死亡的主要原因，因此抗肝癌治疗的关键在于抗侵袭转移。肿瘤细胞转移是一个复杂的过程，包括细胞从原发灶脱落，侵犯和破坏周围的正常组织，迁移入血液或者淋巴系统，粘附于适宜的部位，诱导细胞增殖，最终形成新的转移灶。所以，转移就是癌细胞侵袭周围组织，迁移到特定的靶器官，并逐渐发展成继发性癌灶的过程。肝癌细胞对基底膜(basement membrane, BM)的侵袭是导致肿瘤生长、浸润及转移的重要因素。BM的主要成分是细胞外基质(extracellular matrix, ECM)。因此,肝癌细胞能否突破ECM是肝癌细胞局部浸润和远处转移的关键。ECM的降解是个极为复杂的过程,其中有诸多因素的参与,而基质金属蛋白酶(matrix metallopro teinases, MMPs)及其抑制物(tissue inhibitor ofmetalloproteinase, TIMPs)在此过程中起着关键作用, MMPs具有降解ECM的作用,而TIMPs则通过抑制MMPs的活性从而抑制ECM的降解。斑蝥素（cantharidin CA）是一种半帖烯毒素，是斑芫青属（Mylabris）昆虫斑蝥抗肿瘤的有效成分，去甲斑蝥素（Norcantharidin，NCTD）是斑蝥素的衍生物，由马来酸和呋喃胺Diels-Alder人工合成，是新型抗肿瘤药物，具有较强的抗肿瘤活性和独特的升高白细胞作用。主要用于治疗肝癌、食管癌及胃癌等。多项研究表明，去甲斑蝥素的抗肿瘤作用机制包括诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖、阻止侵袭转移、抗血管生成和/或抗血管生成拟态，但去甲斑蝥素对各种肿瘤细胞生物学行为的影响及其机制还不是很清楚，需要进一步研究，我们将就去甲斑蝥素对肝癌细胞迁移、侵袭的影响及机制进行研究。目的：本实验主要是通过不同浓度的NCTD干预肝癌SMMC-7721细胞，研究其对人肝癌SMMC-7721细胞迁移、侵袭的影响，通过MMP-2和TIMP-2蛋白及mRNA的表达，探讨MMPs和TIMPs在此过程中发挥的作用及相关作用机制。方法：培养人肝癌细胞SMMC-7721，将其分为对照组和不同浓度NCTD干预组，浓度分别为1.0μg/ml、2.0μg/ml、4.0μg/ml。采用划痕愈合和Transwell小室实验检测不同浓度去甲斑蝥素对SMMC-7721细胞迁移与侵袭能力的影响；应用免疫细胞化学法、实时荧光定量PCR法分别检测不同浓度去甲斑蝥素作用于SMMC-7721细胞后MMP-2、TIMP-2蛋白及mRNA的表达情况。结果：1划痕实验结果显示，24小时之后空白对照组细胞已经重新融合91.52%，相比，1.0μg/ml组愈合率为77.63%，2.0μg/ml组愈合率为58.90%，4.0μg/ml组愈合率只有32.24%。药物干预组与对照组相比迁移力明显下降，差异有统计学意义，P<0.05，并随着药物浓度的增加，对细胞的迁移抑制作用也更加明显，说明NCTD对SMMC-7721细胞迁移力的抑制呈剂量依赖性。2细胞侵袭实验显示，与对照组相比，1.0μg/ml药物干预组细胞的侵袭力明显降低(91.00±12.87vs129.23±17.58)，P<0.05；2.0μg/ml药物干预组细胞的侵袭力较1.0μg/ml组降低(57.35±15.94vs91.00±12.87)，P<0.05；4.0μg/ml药物干预组的细胞侵袭力最低，与2.0μg/ml组相比侵袭力进一步下降(32.00±8.02vs57.35±15.94)， P<0.05，差异有统计学意义。3免疫细胞化学检测NCTD对SMMC-7721细胞MMP-2、TIMP-2蛋白表达的影响，结果显示：不同浓度（1.0μg/ml、2.0μg/ml、4.0μg/ml）的NCTD作用于SMMC-7721细胞后与对照组相比， MMP-2蛋白的表达呈下降趋势（0.0899±0.0073,0.0686±0.0034,0.0423±0.0036vs0.1331±0.0060），P<0.05；相反，TIMP-2蛋白的表达水平则呈上升趋势（0.0431±0.0031,0.0709±0.0042,0.1021±0.0063vs0.0162±0.0040），P<0.05，差异有统计学意义，且存在一定的剂量依赖性。（4）NCTD对SMMC-7721细胞MMP-2和TIMP-2mRNA表达的影响，实时荧光定量PCR检测结果显示：与对照组相比，随着NCTD浓度的增加（1.0μg/ml、2.0μg/ml、4.0μg/ml），MMP-2mRNA的表达水平逐渐减少（0.89±0.15，0.71±0.10，0.52±0.14vs1.00±0.14，P<0.05），而TIMP-2mRNA的表达水平逐渐增加（1.31±0.17，1.60±0.17，1.83±0.14vs1.00±0.10，P<0.05），差异有统计学意义，且存在一定的剂量依赖性。结论：去甲斑蝥素抑制了人肝癌SMMC-7721细胞的迁移和侵袭能力，并与药物浓度成正相关，其机制可能与MMP-2和TIMP-2的表达有关。

全文目录

摘要  4-7
ABSTRACT  7-10
前言  10-11
材料与方法  11-21
结果  21-23
附图  23-27
附表  27-28
讨论  28-31
结论  31-32
参考文献  32-36
综述基质金属蛋白酶及其组织抑制剂在肝癌侵袭、迁移中的作用的研究  36-48
  参考文献  43-48
致谢  48-49
个人简历  49

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