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BRD4在白血病细胞定向分化中的作用及关键机制的研究

作　者: 韦若颍
导　师: 毕可红
学　校: 济南大学
专　业: 内科学
关键词: 白血病 诱导分化 全反式维甲酸 丙戊酸钠 BRD4
分类号: R733.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


背景丙戊酸钠(VPA)是治疗癫痫的一种传统药物,已经证实其在临床剂量范围内有着组蛋白乙酰化酶(HDAC)抑制剂的特征性作用,能够提高组蛋白乙酰化水平,使组蛋白与DNA结合增强,进而促使靶基因转录,纠正基因表达的调控异常,最终可以诱导肿瘤细胞分化与凋亡。体外实验证实,其能抑制多种白血病细胞生长。目前,已有大量实验证明组蛋白乙酰化酶抑制剂(HDACi)代表药物VPA可以明显促进全反式维甲酸(ATRA)诱导白血病细胞株HL-60的分化作用。BRD(a double bromodomain-containing protein)是bromodomain BET家族成员,包含两个溴基结构的蛋白,可优势结合乙酰化染色质,从而改变染色质构象。研究已发现,BRD4在基因组复制、转录、细胞周期调控、肿瘤发生及病毒基因组分离等过程中均起关键性作用。2011年9月国外首次有文献报道,BRD4作为治疗急性髓系白血病的一种核苷酸调控靶点,用shRNA或者小分子抑制剂在体内外抑制BRD4可以引起稳定的抗白血病作用,包括终末骨髓的分化和白血病干细胞的消除。但在白血病诱导分化治疗中,BRD4表达、靶向调控BRD4表达后在诱导分化中的作用至今仍不十分明确。本研究通过建立全反式维甲酸联合HDAC抑制因子VPA诱导的白血病细胞分化模型,以探讨不同诱导分化剂对白血病细胞株HL-60中BRD4表达变化的影响及作用的机制,以探索其抗肿瘤机制中的作用靶点,为以后与相关靶向药物联合应用治疗急性早幼粒细胞白血病提供实验依据。目的本实验以人急性早幼粒白血病HL-60细胞株为研究对象,重点观察全反式维甲酸(ATRA)联合丙戊酸钠(VPA)诱导HL-60细胞分化过程中BRD4表达的变化,初步阐明BRD4介导白血病细胞分化的可能机制和结构基础,为细胞分化的研究开辟新的领域,为寻找白血病治疗手段提供新的思路与实验线索。方法建立ATRA联合VPA诱导白血病细胞株HL-60的分化模型, Wright-Gimesa染色观察HL-60细胞形态,CCK8法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD11b的表达,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质印记(Western blot)分别从mRNA和蛋白水平检测HL-60细胞经药物诱导24h、48h、72h后BRD4表达的变化。另一方面,构建BRD4的真核表达载体,为今后电转染过表达BRD4奠定基础；用siRNA方法干扰BRD4的表达。测定结果用x士s表示,均数比较采用t检验,组间比较采用单因素方差分析,以p<0.05为有统计学意义,p<0.01为有显著性差异。结果单独应用ATRA或VPA均能够明显抑制白血病细胞生长,诱导细胞分化,倒置显微镜下可观察到HL-60细胞向成熟粒细胞方向分化,细胞增殖受到抑制,细胞表面的分化抗原表达升高,VPA lmmol/L+ATRA0.5μmol/L联合诱导分化模型中细胞增殖效果更明显、细胞表面分化抗原表达升高更明显,两者均有统计学意义,在mRNA水平和蛋白水平BRD4的表达逐渐降低,VPA lmmol/L+ATRA0.5μmol/L联合诱导分化模型中降低更明显,两者有统计学意义。其具体分子机制有待进一步研究。结论ATRA或VPA作用白血病细胞HL-60后,抑制细胞增殖,诱导白血病细胞向粒系分化,并且两药联合诱导分化效果更好,说明VPA可以明显的促进ATRA诱导白血病细胞的分化作用,与之前的研究结果相同；BRD4的表达程度随着急性早幼粒白血病HL-60细胞的分化程度增高出现下降趋势,转录水平与蛋白水平一致,表达量与白血病的恶性程度正相关,提示BRD4在白血病的发病过程中抑制细胞向成熟方向分化,在急性早幼粒细胞白血病的诱导分化过程中起了重要作用；本研究为临床联合应用VPA和小剂量ATRA的诱导分化治疗髓系白血病提供了实验和理论基础,为靶向联合化疗治疗恶性肿瘤提供了新的思路。

全文目录


研究生导师及课题小组成员简介  4-6
目录  6-8
中文摘要  8-11
ABSTRACT  11-15
主要符号表  15-16
前言  16-21
材料与方法  21-33
  1.1 主要材料仪器  21-23
  1.2 细胞培养及细胞形态学观察  23
  1.3 急性早幼粒白血病细胞(HL-60)不同诱导分化模型的建立  23
  1.4 CCK8法测定细胞增殖  23-24
  1.5 细胞表面标志的改变  24
  1.6 逆转录PCR分析  24-27
  1.7 蛋白质印迹分析  27-29
  1.8 BRD4真核表达载体的构建中蛋白基因的克隆—PCR获取BRD4目的基因  29-31
  1.9 BRD4 siRNA干扰试验  31-32
  1.10 统计学处理方法  32-33
结果  33-40
  2.1 Wright-Gimesa染色观察HL-60细胞分化现象  33
  2.2 ATRA和VPA联合对HL-60细胞增殖、分化作用的影响  33-35
  2.3 ATRA和VPA联合对HL-60细胞BRD4表达水平的影响  35-37
  2.4 BRD4真核表达载体构建之目的基因BRD4的获取  37-38
  2.5 BRD4 siRNA的结果  38-40
讨论  40-45
结论  45-46
参考文献  46-51
综述  51-60
  参考文献  57-60
攻读硕士学位期间的研究成果  60-61
致谢  61

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 造血器及淋巴系肿瘤 > 白血病
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