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抗人ppGalNAc-T2单克隆抗体制备以及慢病毒介导ppGalNAc-T2基因表达对白血病细胞恶性表型的影响

作　者: 刘春亮
导　师: 吴士良
学　校: 苏州大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: O-糖基化 多肽: N-乙酰氨基半乳糖转移酶2 单克隆抗体 慢病毒 白血病
分类号: R733.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的:O-糖基化异常与多种疾病密切相关,ppGalNAc-Ts酶家族作为催化黏蛋白型O-聚糖合成的起始酶,在肿瘤中出现的ppGalNAc-Ts异常表达已经被认为是肿瘤特异聚糖结构产生的重要机制之一。有研究发现,与正常组织或细胞相比,ppGalNAc-T2在结肠癌、乳腺癌等肿瘤中存在异常表达。为了研究ppGalNAc-T2基因在表达及其功能,本实验制备特异性抗人ppGalNAc-T2单克隆抗体,并对该抗体的特性及应用进行分析。方法:(1)抗原制备:利用PCR的方法从人293T细胞中克隆ppGalNAc-T2的编码区cDNA,构建pET-32a(+)-ppGalNAc-T2原核表达重组载体,载体经鉴定后转化至大肠杆菌BL21宿主菌,采用自动诱导方案表达ppGalNAc-T2融合蛋白;融合蛋白经凝胶纯化并鉴定后获得免疫用抗原;(2)杂交瘤及单克隆抗体制备:免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合技术构建杂交瘤细胞,经间接ELISA和流式细胞术双筛选方法来获得稳定、高效分泌抗ppGalNAc-T2抗体的杂交瘤细胞株;然后采用小鼠体内腹水诱生法大量制备腹水型单抗;(3)单克隆抗体特性分析及其应用:测定单克隆抗体的亚类,然后将单克隆抗体用于间接ELISA,原核蛋白及真核蛋白的Western Blot分析,流式细胞术以及细胞免疫荧光分析。结果:筛选出一株稳定分泌抗人ppGalNAc-T2单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为LW-5F3,保藏号NO.C2010106;该单抗亚类为IgMκ;Western blot分析该单克隆抗体不仅识别原核表达的ppGalNAc-T2融合蛋白,还特异识别L929-ppGalNAc-T2转基因细胞表达的ppGalNAc-T2真核蛋白;流式细胞术分析检测到白血病Jurkat细胞和肝癌HepG2细胞均表达ppGalNAc-T2蛋白,并对肝癌HepG2细胞中ppGalNAc-T2蛋白表达情况进行了免疫荧光分析。第二部分:慢病毒介导ppGalNAc-T2基因表达对白血病细胞恶性表型的影响目的:白血病细胞株在经全反式维甲酸诱导分化过程中ppGalNAc-T2基因出现表达异常,而且有研究发现抑制O-糖基化可影响结肠癌和淋巴瘤等肿瘤的生长恶化。我们推测ppGalNAc-T2的表达及其控制合成的O-糖链在白血病中可能有着重要的作用。为此我们利用慢病毒转染手段,来研究ppGalNAc-T2基因表达对白血病Jurkat细胞恶性表型的影响,来探讨O-糖基化在白血病中的作用。方法:(1)慢病毒过表达载体构建:利用PCR的方法从人293T细胞中克隆ppGalNAc-T2的编码区cDNA,构建慢病毒重组质粒venus-ppGalNAc-T2,将重组质粒及包装质粒共转染至293T细胞产生病毒颗粒,毒液经纯化并进行滴度测定;(2)慢病毒RNAi载体构建:设计并合成靶向沉默ppGalNAc-T2基因表达的shRNA及negative control,经退火后连接至慢病毒载体YH1上,病毒产生及滴度测定等操作同上;(3)白血病Jurkat细胞转染:将(1)和(2)所得慢病毒感染Jurkat细胞,然后进行经流式分选仪分选YFP阳性细胞,每个单细胞单独培养为单克隆细胞株,经流式细胞术,半定量RT-PCR和Western blot鉴定后,获得Jurkat细胞ppGalNAc-T2过表达及RNAi模型;(4)实验分析ppGalNAc-T2表达改变后,Jurkat细胞增殖、粘附以及TransWell迁移能力的改变。结果:成功构建了重组慢病毒ppGalNAc-T2过表达载体和慢病毒RNAi载体,感染Jurkat细胞经流式细胞仪分选,半定量RT-PCR和Western blot实验鉴定获得了稳定转染Jurkat细胞株;MTT实验,细胞粘附实验和Transwell细胞迁移实验分析表明ppGalNAc-T2过表达可促进Jurkat细胞的增殖,粘附及细胞迁移能力;当ppGalNAc-T2表达被RNAi沉默后,Jurkat细胞的增殖,粘附和迁移能力降低。

全文目录


中文摘要  4-6
Abstract  6-9
前言  9-17
  参考文献  13-17
第一部分 抗人ppGalNAc-T2 单克隆抗体的制备及应用  17-42
  材料与方法  17-32
  结果  32-39
  讨论  39-40
  参考文献  40-42
第二部分 慢病毒介导ppGalNAc-T2 表达对白血病细胞恶性表型的影响  42-64
  材料与方法  42-51
  结果  51-59
  讨论  59-61
  参考文献  61-64
结论  64-65
综述  65-80
  参考文献  74-80
硕士学习期间发表的论文、专利和获奖情况  80-81
附录 中英文缩略词表  81-83
致谢  83-84

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 造血器及淋巴系肿瘤 > 白血病
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