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HER2胞外区基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

作　者: 丰雪
导　师: 甄宇红
学　校: 大连医科大学
专　业: 药理学
关键词: HER2胞外区重组表达载体 pET28a pET30a
分类号: R73-36
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：原癌基因HER2（human epidermal growth factor receptor2，HER2）是表皮生长因子受体家族中的一员，具有内在的酪氨酸激酶活性，包括信号肽、胞外区、跨膜区和胞内区四个部分。HER2在正常细胞中含量很低，但在乳腺癌、胃癌、卵巢癌等组织细胞中表达量很高，其表达与肿瘤病程的进展及不良预后密切相关。HER2胞外区定位于肿瘤细胞表面，使其成为肿瘤免疫治疗的理想靶点。本研究的目的是构建HER2蛋白重组表达载体，在大肠杆菌中表达HER2胞外区蛋白，为后续HER2抗体及肿瘤蛋白疫苗的制备奠定基础。方法：（1）HER2胞外区模板的克隆：应用RT-PCR技术从人乳腺癌细胞SKBR-3中克隆出HER2的整个胞外区基因。（2）表达载体的构建：以克隆的HER2胞外区为模板，采用PCR分别扩增出HER2胞外区的远膜端和近膜端基因片段，将之分别插入表达载体pET28a和pET30a构建重组表达载体。采用载体上T7通用引物对构建好的表达载体进行测序。（3）目的蛋白的诱导表达：将构建成功的重组载体转化至大肠杆菌BL21（DE3）细胞中，加入IPTG在37℃诱导表达，SDS-PAGE和Western-blotting考察蛋白是否成功表达。（4）诱导表达条件的优化：通过改变诱导温度和诱导时间，寻找最佳表达条件，使目的蛋白的表达量最高。结果：（1）琼脂糖凝胶电泳显示在接近2000bp处出现了一条特异性条带，表明HER2胞外区模板克隆成功。（2）重组质粒测序结果表明插入的DNA片段与目的片段序列完全一致，质粒构建成功。（3）质粒转化大肠杆菌后，SDS-PAGE结果显示在目的蛋白相应位置均出现特异性条带，表明HER2两段胞外区蛋白表达成功，且以包涵体形式存在。（4）通过改变诱导条件，确定37℃，IPTG诱导4h，目的蛋白的表达量最高。结论：利用构建的重组蛋白表达载体在大肠杆菌中成功表达HER2两段胞外区蛋白，为HER2特异性抗体的制备及肿瘤蛋白疫苗的研究奠定了基础。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-11
前言  11-12
材料和设备  12-16
  1 细胞系、菌株及质粒  12
  2 药品及试剂  12-13
  3 主要仪器  13
  4 溶液配制  13-16
实验方法  16-27
  1 SKBR3 细胞中 HER2 表达的检测  16-17
  2 HER2 胞外区 cDNA 模板的构建  17-21
  3 HER2表达载体的构建  21-25
  4 HER2胞外段在大肠杆菌中的表达  25-26
  5 HER2胞外段蛋白表达条件的优化  26-27
实验结果  27-36
  1 SKBR3 细胞中 HER2 表达的检测  27-29
  2 HER2 胞外区 cDNA 模板的构建  29-30
  3 HER2 表达载体的构建  30-33
  4 HER2 胞外段蛋白在大肠杆菌中的表达  33-34
  5 HER2 胞外区蛋白表达条件的优化  34-36
讨论  36-38
结论  38-39
参考文献  39-41
综述  41-52
  参考文献  48-52
附录  52-55
发表论文  55-56
致谢  56-57

HER2胞外区基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

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