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嗜肺军团菌mip基因的克隆与表达

作　者: 张雪
导　师: 余倩；邵祝军
学　校: 四川大学
专　业: 营养与食品卫生学
关键词: 嗜肺军团菌 mip基因 Mip蛋白 pET30a(+) E. coli BL21(DE3)
分类号: R117
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

目的通过扩增嗜肺军团菌mip(macrophage infectivity potentiator，mip)基因，构建pET-mip重组子，实现嗜肺军团菌mip基因在大肠埃希菌中的高效表达，并进行表达产物的纯化和定量检测。方法设计引物，PCR扩增目的基因mip，与质粒pET30a(＋)连接，构建表达重组子pET-mip。将表达重组子转化E.coli DH5α，利用卡那霉素抗性筛选阳性克隆。质粒小量提取后，经PCR扩增、双酶切和测序鉴定。经过鉴定的表达重组子转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，SDS-PAGE和Western-blotting分析重组菌pET-mip表达融合蛋白Mip的情况，并对融合蛋白进行镍离子(Ni~+)亲和层析纯化和定量检测。结果1成功构建嗜肺军团菌mip基因的原核表达重组质粒pET-mip。此质粒经双酶切后，得到表达载体片断和目的基因片断(702bp)；经测序，目的基因全长702bp，与GenBank中公布的序列相比对，仅存在5个碱基的差异，相似性大于99％。编码含234个氨基酸残基的多肽链，2经IPTG诱导，含重组质粒pET-mip的表达宿主菌E.coli BL21(DE3)在SDS-PAGE上大约30kD处有明显的表达条带，与核酸序列测定所推导的Mip融合蛋白分子量相符。经Western-blotting分析，证实为Mip融合蛋白。变性条件下，将重组蛋白通过镍离子(Ni~+)亲和层析进行纯化，纯化产物总蛋白浓度达到1mg/ml。结论本研究成功构建了原核表达重组质粒pET-mip，实现了嗜肺军团菌巨噬细胞感染增强蛋白Mip在原核细胞中的高效表达，通过变性条件下的镍离子亲和层析，获得纯度较高的Mip融合蛋白，蛋白浓度达到1mg／ml。

全文目录

缩略词  7-9
中文摘要  9-11
英文摘要  11-13
前言  13-17
课题技术路线  17-18
第一部分嗜肺军团菌 mip基因原核表达重组质粒的构建  18-38
  1.实验材料  18-21
  2.实验方法  21-26
  3.实验结果  26-34
  4.讨论  34-38
第二部分嗜肺军团菌Mip融合蛋白的表达、鉴定、纯化和定量  38-50
  1.实验材料  38-39
  2.实验方法  39-43
  3.实验结果  43-46
  4.讨论  46-50
全文总结  50-51
参考文献  51-54
综述  54-69
致谢  69

嗜肺军团菌mip基因的克隆与表达

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