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Sulfiredoxin-1经Nrf2/ARE通路保护PC12细胞氧化损伤的机制研究

作　者: 邹颜阳
导　师: 张徽
学　校: 重庆医科大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: H2O2 PC12细胞 Sulfiredoxin-1 氧化损伤 氧化应激
分类号: R743.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


脑卒中等脑缺血性疾病有着居高不下的发病率、致残率与死亡率，给社会造成严重的社会经济学代价。脑缺血再灌注使机体产生氧化应激，造成活性氧产生与机体的内源性抗氧化防御系统清除能力的平衡失调。内源性小分子抗氧化蛋白，Sulfiredoxin-1，属于Sulfiredoxin（Srx）抗氧化蛋白家族的成员。有研究表明处于氧化/抗氧化失衡状态的慢性肺部阻塞性疾病患者的肺组织中，内源性抗氧化酶Srxn1的表达极低，而过表达Srxn1可以保护肺脏组织免受氧化攻击损伤，也可以保护皮质神经元与星形胶质细胞免受过氧化物的氧化性损伤。本课题拟采用干扰Srxn1基因表达，在体外以H2O2诱导PC12细胞氧化损伤模拟神经元在脑缺血再灌注中的氧化损伤，探讨Sulfiredoxin-1对H2O2诱导的PC12细胞氧化损伤的保护作用及其可能机制。方法：（1）应用脂质体转染技术将Srxn1基因干扰质粒及阴性对照质粒瞬时转染至PC12细胞中，倒置荧光显微镜观察转染效率，以β-actin为内参，Western blot方法检测Srxn1蛋白水平的表达，半定量检测Srxn1mRNA水平的表达,确认干扰效率。（2）以H2O2浓度为0、180μmol/L的培养液作用于各组细胞24h后，MTS方法检测各组细胞存活率。（3）H2O2处理各组细胞后，破碎各组细胞，收集样本，按试剂盒说明书,检测MDA含量。（4）H2O2处理各组细胞后，分别提取细胞核蛋白与细胞浆蛋白，以β-actin为胞浆内参，Lamin A为胞核内参，用Western blot方法检测Nrf2、actin蛋白水平。（5）H2O2处理各组细胞后，分别提取各组细胞总蛋白与总RNA，以β-actin为内参，半定量PCR检测HO-1、NQO1mRNA水平，Westernblot检测蛋白水平。结果：（1）成功转染携带siRNA的Srxn1干扰质粒与阴性质粒，RT-PCR及Western blot证实Srxn1干扰组的Srxn1mRNA及蛋白表达水平与未转染组与阴性转染组比较明显减低，未转染组与阴性转染组表达无差异。（2）细胞生存率（%）：PC12细胞经200μM的H2O2培养液培养24h后，与正常对照组相比，细胞活力下降，而干扰Srxn1可以加重这一损伤。（3）MDA含量（nmol/mgpro）:各组细胞暴露于含H2O2的培养液12h后，检测MDA含量均增加，Srxn1干扰组（5.507±0.29）的MDA水平高于未转染组与阴性载体组，未转染组与阴性载体组相比差异不显著（P>0.05）。（4）Nrf2蛋白水平表达: H2O2损伤后，各组细胞胞浆内Nrf2蛋白水平表达下降，而Srxn1干扰组的这一下降趋势要弱于未转染组与阴性载体组。而各组细胞在H2O2损伤后细胞核内的Nrf2蛋白水平表达升高，Srxn1干扰组Nrf2蛋白水平表达较未转染组与阴性载体组要低（P<0.05）。（5）actin蛋白水平表达:H2O2处理后，各组细胞胞浆内actin蛋白水平表达下降，而Srxn1干扰组的这一下降趋势要弱于未转染组与阴性载体组。而各组细胞在H2O2损伤后细胞核内的actin蛋白水平表达升高，Srxn1干扰组的actin蛋白水平表达较未转染组与阴性载体组要低（P<0.05）。（6）HO-1的表达：各组细胞暴露于H2O212h后，HO-1mRNA的表达在未转染组（0.729vs.0.458）、阴性转染组（0.625vs.0.463）及Srxn1干扰组（0.53vs.0.478）均较损伤前明显升高，而Srxn1干扰组这一趋势明显低于其他两组（p<0.05），未转染组与阴性转染组比较无差异（P>0.05）。与H2O2损伤前相比，HO-1的蛋白水平表达在未转染组（1.107vs.0.63）、阴性转染组（1.019vs.0.581）及Srxn1干扰组（0.754vs.0.644）均明显升高，而Srxn1干扰组的升高明显低于其他两组（P<0.05），未转染组与阴性转染组比较无差异（P>0.05）。（7）NQO1的表达: H2O2损伤后，Srxn1干扰组的NQO1mRNA表达水平较损伤前升高（0.827vs.0.557）,未转染组（0.868vs.0.547）与阴性载体组（0.915vs.0.566）同样升高，但损伤后Srxn1干扰组较未转染组与阴性载体组明显降低（P<0.05），而未转染组与阴性载体组比较无差异（P>0.05）。H2O2损伤后Srxn1干扰组的NQO1蛋白水平与未转染组与阴性载体组相比明显较低（P<0.05），未转染组与阴性载体组比较无差异（P>0.05）。结论：（1）Srxn1能保护PC12细胞抵御H2O2造成的氧化损伤，干扰Srxn1后可以增强H2O2对PC12细胞的氧化损伤，增加氧化应激时MDA的生成。（2）Srxn1保护PC12细胞减轻H2O2损伤，这一作用可能通过参与Nrf2与actin的核转位，进一步促使下游HO-1、NQO1等氧化应激蛋白释放来实现的。

全文目录


英汉缩略语名词对照  5-6
摘要  6-10
ABSTRACT  10-15
前言  15-17
1 材料与方法  17-26
2 结果  26-31
3.讨论  31-34
结论  34-35
参考文献  35-38
文献综述  38-45
  参考文献  41-45
致谢  45-46
硕士期间发表的论文  46-47

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中图分类: > 医药、卫生 > 神经病学与精神病学 > 神经病学 > 脑血管疾病 > 急性脑血管疾病（中风）
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