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小鼠血管生成素-1慢病毒表达载体的构建及鉴定

作　者: 马兴娜
导　师: 封志纯
学　校: 山西医科大学
专　业: 儿科学
关键词: 慢病毒 血管生成素-1 Gateway技术
分类号: R722.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 5次
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内容摘要


目的：构建携带小鼠血管生成素-1(Angiopoietin-1, Ang-1)基因的慢病毒载体并对重组载体进行鉴定,为进一步研究通过Ang-1基因疗法治疗BPD提供实验基础。方法：(])以pcDNA-Ang-1为模板,采用聚合酶链反应扩增前后端带有attB重组位点的Ang-1全长序列；(2)利用Gateway技术通过BP反应构建入门克隆pDown-Ang-1；(3)应用PCR及基因测序对入门克隆进行鉴定；(4)通过LR反应将pDown-Ang-1与质粒pUp-CMV、pDown-Ang-1、pTail-IRES/DsRed-Express2和母载体PLV. Des3d.P/puro进行重组反应,构建携带DsRed荧光蛋白的Ang-1慢病毒表达载体PLV. Ex3d.P/puro-CMV>Ang-1>IRES/DsRed-Express2;(5)应用PCR及基因测序对表达载体进行鉴定；(6)将PLV.Ex3d.P/puro-CMV>Ang-1>IRES/DsRed-Express2与辅助质粒(pLV/helper-SL3、pLV/helper-SLA及pLV/helper-SL5)采用脂质体法共同转染293FT细胞进行慢病毒的包装,产生相应的慢病毒颗粒,通过荧光表达情况来测定病毒滴度和感染效率。结果：PCR及基因测序证实,通过BP反应成功构建了入门克隆pDown-Ang-1,通过LR反应成功构建了Ang-1慢病毒表达载体PLV. Ex3d.P/puro-CMV>Ang-1> IRES/DsRed-Express2,慢病毒表达载体全长序列10621bps, CMV启动子序列1950bp-2538bp, Ang-1开放阅读框架序列2569bp-4065bp, IRES序列4080bp-4677bp, DsRed-Express2序列4678bp-5355bpo与辅助质粒(pLV/helper-SL3、 pLV/helper-SL4及pLV/helper-SL5)采用脂质体法共同转染293FT细胞后细胞内可见荧光的表达,且包装出具高效感染力的慢病毒,根据荧光表达情况测定病毒滴度为5×108TU/ml。结论：应用Gateway技术成功构建了Ang-1慢病毒表达载体PLV.Ex3d.P/puro-CMV>Ang-1>IRES/DsRed-Express2,并包装出具高效感染力的慢病毒颗粒,为进一步研究通过Ang-1基因疗法治疗BPD提供了实验基础。

全文目录


缩略语表  6-7
中文摘要  7-9
Abstract  9-11
前言  11-14
材料与方法  14-27
  1 实验材料  14-17
    1.1 仪器设备  14-15
    1.2 试剂  15-16
    1.3 主要溶液及配置方式  16-17
  2 方法  17-27
    2.1 利用聚合酶链反应获得attB1-K-Ang-1-attB2  17-19
    2.2 构建入门克隆pDown-Ang-1  19-20
    2.3 入门克隆pDown-Ang-1的筛选及鉴定  20-21
    2.4 构建重组质粒PLV.Ex3d.P/puro-CMV>Ang-1>IRES/DsRed-Express2  21-22
    2.5 重组质粒筛选及鉴定  22-23
    2.6 慢病毒包装  23-25
    2.7 慢病毒滴度测定  25-27
结果  27-32
  1 PCR扩增attB1-K-Ang-1-attB2产物回收  27
  2 菌落PCR筛选入门克隆pDown-Ang-1  27-28
  3 菌落PCR筛选PLV.Ex3d.P/puro-CMV>Ang-1>IRES/DsRed-Express2  28-29
  4 重组慢病毒的包装  29-31
  5 病毒滴度的测定  31-32
讨论  32-38
结论  38-39
参考文献  39-44
综述  44-58
  参考文献  53-58
附录  58-66
攻读学位期间发表文章情况  66-67
致谢  67-68
个人简历  68

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