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子宫平滑肌细胞中SM22α蛋白的作用机制研究

作　者: 胡灵玉
导　师: 周昌菊
学　校: 中南大学
专　业: 妇产科学
关键词: SM22α蛋白 细胞内钙离子 硫酸镁 缩宫素 分娩发动
分类号: R714.3
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


我们课题组前期研究中,发现分娩发动前后子宫体体部SM22α表达存在差异。资料显示SM22α是钙结合蛋白,也是细胞骨架蛋白,该蛋白可通过促进actin纤维聚集成束,形成应力纤维而在平滑肌收缩过程中起调节作用。也有资料显示SM22α调控基质金属蛋白酶9(mmp-9)转录。这些研究都在血管平滑肌细胞中体现。SM22α蛋白在子宫平滑肌作用没在文献中体现。而分娩过程是子宫平滑肌协调收缩完成,虽然分娩是由多因素作用、多途径调节、多分子参与、多阶段变化的交互作用过程,但子宫平滑肌的收缩是分娩发动的关键环节。若能探明SM22α在分娩发动中的和作用机制对完善分娩动因理论具有重要的临床意义。本研究具体探讨SM22α在子宫平滑肌中作用及作用机制。第一章临产前后子宫体部、下段、胎盘、胎膜SM22α蛋白的表达目的：探索SM22α蛋白在分娩过程中的表达及意义。方法：选取2008年1月-2009年9月中南大学湘雅三医院住院分娩的12例剖宫产初产妇的子宫体部、下段、胎盘、胎膜组织,分为未临产组和临产组,采用Western Blot方法检测组织中SM22α蛋白的表达。结果：12例产妇的子宫体部、下段、胎盘中均有SM22α蛋白表达,胎膜不表达SM22α蛋白；胎盘部分表达SM22α蛋白,已临产与未临产的表达无统计学差异；子宫体部表达的SM22α蛋白,已临产高于未临产p<0.05；子宫下段表达的SM22α蛋白已临产后低于未临产p<0.05。结论：胎膜不表达SM22α蛋白；胎盘部分血管平滑肌表达SM22α蛋白,临产前后表达无差异,推论血管平滑肌在分娩发动可能不起作用；子宫体部平滑肌表达SM22α蛋白,且临产后明显高于未临产；子宫下段平滑肌表达SM22α蛋白,且临产后明显低于未临产；推论分娩发动子宫体平滑肌起主导作用,控制分娩协调进程。子宫平滑肌SM22α蛋白可能是分娩发动的重要蛋白因子。第二章妊娠期子宫平滑肌细胞的原代培养及鉴定目的：获得体外研究SM22α蛋白的原代培养的人妊娠期子宫平滑肌细胞。方法：选取足月初产剖宫产产妇子宫体部平滑肌组织分别采用组织块贴壁培养法和酶消化法进行子宫平滑肌细胞原代培养,进而采用细胞免疫化学的方法进行鉴定。结果：成功培养出妊娠期子宫平滑肌细胞；荧光显色显示SM22a在子宫平滑肌细胞中与肌动蛋白走向一致,呈条索状。结论：成功获得原代培养的子宫平滑肌细胞；子宫平滑肌中SM22a蛋白在形态学上与子宫平滑肌细胞中肌动蛋白走向一致,呈条索状,推测SM22α蛋白在子宫平滑肌细胞起骨架作用。第三章pCMV-Myc-SM22a质粒的构建和有效siRNA筛选目的：构建含SM22a基因的pCMV-Myc-SM22a质粒和筛查高效SiRNA序列用于体外研究。方法：人SM22a基因序列由Gene Bank获得,通过PRIMER PREMIER软件设计SM22a引物序列和SiRNA引物序列,利用基因克隆技术构建pCMV-Myc-SM22a质粒；进一步利用基因技术在293FT细胞上表达SM22a,筛查有效的SiRNA引物；最后在体外培养的子宫平滑肌细胞进行高效SiRNA引物验证。结果：成功构建pCMV-Myc-SM22a质粒,并获得有效SiRNA序列：siRNA SM22-252正义链5’-CCAUGGUCUUCAAGCAGAUTT-3’反义链5’-AUCUGCUUGAAGACCAUGGAG-3’siRNA SM22-444正义链5’-CCAACUGGUUUAUGAAGAATT-3’反义链5’-UUCUUCAUAAACCAGUUGGGA-3’结论：pCMV-Myc-SM22α质粒能有效在子宫平滑肌细胞上表达；获得特异抑制原代体外培养细胞SM22α蛋白表达的SiRNA序列；体外原代培养妊娠期子宫平滑肌细胞2-4代适合进行小干扰和过表达处理。第四章缩宫素、硫酸镁对子宫平滑肌细胞SM2α蛋白表达和钙离子浓度的影响目的：探索体外培养人妊娠子宫平滑肌细胞中SM22α蛋白作用机制。方法：用缩宫素、硫酸镁不同时间、不同浓度刺激体外原代培养子宫平滑肌细胞,采用Western blot方法检测细胞中SM22α蛋白表达；然后选择一定作用时间、药物浓度作用于过表达SM22α、小干扰SM22α表达和正常培养的体外原代培养子宫平滑肌,用荧光定量法检测细胞内游离钙离子浓度。结果：体外实验表明缩宫素上调子宫平滑肌SM22α蛋白的表达,与缩宫素刺激的时间、剂量相关,表现时间、剂量储积性；体外实验硫酸镁抑制SM22α蛋白的表达,硫酸镁抑制SM22α蛋白与硫酸镁刺激的时间剂量相关,表现时间和剂量耐受性；SM22α蛋白过表达细胞内游离钙离子明显降低与正常培养相比具显著差异p<0.01；沉默SM22α蛋白表达升高细胞内游离钙离子浓度,与正常对照组相比具非常显著差异p<0.01；SM22α蛋白过表达硫酸镁刺激细胞内钙离子降低,与正常培养相比无显著差异p>0.05；小干扰SM22α蛋白表达硫酸镁刺激升高细胞内钙离子浓度,与正常对照组相比具显著差异p<0.05;SM22a蛋白过表达缩宫素刺激降低细胞内钙离子浓度,与正常培养相比具非常显著差异p<0.01；沉默SM22α蛋白表达缩宫素刺激升高细胞内钙离子浓度,与正常对照组相比不具差异p<0.01。结论：缩宫素上调SM22α蛋白的表达；硫酸镁抑制SM22α蛋白的表达,与时间、剂量相关；SM22α蛋白可能通过调控子宫平滑肌细胞内钙离子的浓度来调控子宫平滑肌的收缩；硫酸镁抑制宫缩可能受到SM22α蛋白表达量的制约；总之,SM22α蛋白在子宫平滑肌可能起骨架作用,可能通过表达量的改变调控细胞内钙离子浓度控制分娩发动,可能是分娩发动的重要蛋白因子。

全文目录


摘要  4-7
ABSTRACT  7-14
中英文缩略语  14-16
前言  16-19
第一章 临产前后子宫体部、下段、胎盘、胎膜SM22α蛋白的表达  19-32
  1.1 材料与方法  19-24
    1.1.1 使用组织来源  19-20
    1.1.2 主要试剂  20
    1.1.3 主要仪器  20-21
    1.1.4 溶液配制  21-22
    1.1.5 Western Blot实验操作步骤  22-24
    1.1.6 统计学方法  24
  1.2 结果  24-27
    1.2.1 临产前后子宫体部SM22α蛋白的表达  24-25
    1.2.2 临产前后子宫下段SM22α的表达  25-26
    1.2.3 临产前后胎盘部位SM22α的表达  26-27
    1.2.4 临产前后胎膜部位SM22α的表达  27
  1.3 讨论  27-31
  小结  31-32
第二章 妊娠期子宫平滑肌细胞的原代培养及鉴定  32-47
  2.1 材料与方法  32-37
    2.1.1 材料  32-34
    2.1.2 方法  34-37
  2.2 结果  37-45
    2.2.1 原代子宫平滑肌细胞的培养  37-40
    2.2.2 荧光免疫染色鉴定结果  40-45
  2.3 讨论  45-46
  2.4 小结  46-47
第三章 pCMV-Myc-SM22α质粒的构建和有效siRNA筛选  47-60
  3.1 材料与方法  47-55
    3.1.1 材料  47-48
    3.1.2 方法  48-55
  3.2 统计方法  55
  3.3 结果  55-59
    3.3.1 重组质粒的鉴定  55-56
    3.3.2 siRNA筛查结果  56-59
  3.4 讨论  59
  小结  59-60
第四章 缩宫素、硫酸镁对子宫平滑肌细胞SM22α蛋白表达和钙离子浓度的影响  60-93
  4.1 缩宫素对体外培养子宫平滑肌细胞SM22α蛋白表达的影响  60-73
    4.1.1 材料与方法  60-64
    4.1.2 统计方法  64
    4.1.3 结果  64-67
    4.1.4 讨论  67-73
  4.2 硫酸镁对体外培养子宫平滑肌细胞SM22α蛋白表达的影响  73-83
    4.2.1 材料与方法  73-76
    4.2.2 统计方法  76-77
    4.2.3 结果  77-79
    4.2.4 讨论  79-83
  4.3 子宫平滑肌SM22α的表达变化与细胞内钙离子浓度关系  83-93
    4.3.1 材料与方法  83-86
    4.3.2 统计方法  86
    4.3.3 结果  86-88
    4.3.4 讨论  88-92
    4.3.5 小结  92-93
综述  93-98
  1. SM22a基因定位  93
  2.SM22a蛋白分子结构和表达特点  93-96
    2.1 种族之间高度同源性  93-94
    2.2 CH结构域  94
    2.3 CLR(calponin-like repeats)  94
    2.4 EF-hand耗结合结构域  94-95
    2.5 SM22a蛋白表达分布和表达调控  95-96
  3. SM22cx蛋白的功能  96-97
    3.1 参与细胞骨架重构和与肌动蛋白相互作用  96
    3.2 参与调控MMP-9的表达  96
    3.3 涉及到细胞的变迁和表型转换  96-97
  4 结语  97-98
参考文献  98-104
致谢  104-105
攻读学位期间主要科研成果  105

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中图分类: > 医药、卫生 > 妇产科学 > 产科学 > 生理分娩（正常分娩）
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