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SM_(22α)蛋白在调控单壁碳纳米管诱导血管外膜成纤维细胞转化中的作用及其机理

作　者: 刘丽华
导　师: 袭著革; 林治卿
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: 单壁碳纳米管大鼠血管外膜成纤维细胞细胞毒性 SM22α蛋白 TGF-β1
分类号: R318.08
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

研究背景:进入21世纪以来,纳米科技飞速发展,也就人造纳米材料的应用领域和商业化生产也不断扩大。同时,人们对各种纳米材料和纳米颗粒的暴露程度也随之加重,而且在生物医药领域纳米材料的应用也越来越广泛,这就意味着纳米材料和纳米颗粒将有更多的机会与血管、血液及其中的成分发生相互作用,从而对人类健康造成影响。由于心血管疾病属于人类重大疾病,严重威胁人类健康与生命,因此开展典型纳米材料暴露所致心血管毒性作用及其机制的研究是十分必要的,可以使人类正确认识和更好利用纳米材料,预防、减少或消除其对健康可能产生的不良影响,并为纳米材料安全性评价提供理论和技术基础。本课题选择单壁碳纳米管(single-walled carbon nanotubes, SWCNTs)作为研究纳米材料致心血管系统毒性作用的典型目标材料。SWCNTs广泛地应用于疾病诊断、辅助成像和药物传输等领域,这也使得血管和血液是其潜在毒性的重要靶点。纳米毒理学研究证实超细粒子可通过肺血屏障进入血液,参加全身的血液循环。有最近的研究显示,外膜不仅是血管的支撑结构,同时集神经-内分泌-免疫功能于一体,是一个结构和功能复杂的组成成分,全程参与了血管重构。而且SWCNTs在穿透肺血屏障进入血管首先受损的是血管外膜,因此我们选择血管外膜成纤维细胞作为研究对象。SM22α(smooth muscle 22 alpha,SM22α)又称转凝蛋白(transgelin),在正常的血管外膜组织中不存在肌成纤维细胞(myofibroblast,MF),当外膜损伤时,VAF转化为MF,其识别特征即为胞浆中出现SM22α蛋白。VAF转化为MF后向血管内膜迁移,增殖,成为新生内膜的细胞成分。MF的产生与多种生长因子和细胞因子有关,其中与转化生长因子β1 (Transfering growth factorβ1,TGF-β1)的关系最密切。因此推测,SM22α的表达主要受TGF-β1信号转导系统及其中间分子Smad蛋白调控。研究目的:本研究的目的在于探讨SWCNTs损伤血管外膜成纤维细胞的生物学途径,阐述SM22α蛋白在调控SWCNTs诱导血管外膜成纤维细胞转化中的作用及其机理。研究方法:1.血管外膜成纤维细胞的原代培养与鉴定Ⅰ型胶原酶消化法原代培养大鼠胸主动脉血管外膜成纤维细胞,采用形态学和免疫学鉴定;2.细胞水平研究: 1)通过MTT和WST方法检测SWCNTs对体外培养细胞存活率的影响并建立染毒模型; 2)检测细胞氧化损伤指标:采用二硫代二硝基苯甲酸法检测GSH含量;黄嘌呤法氧化酶法检测SOD活性;硫代巴比妥酸法检测MDA含量; 3)采用透射电镜观察在不同作用条件下SWCNTs暴露致血管外膜成纤维细胞超微结构的损伤等; 3.分子水平研究:观察不同暴露条件下SWCNTs对体外培养的成纤维细胞中SM22α和TGF-β1表达含量的影响。1)采用实时荧光定量PCR的方法研究SM22α、TGF-β1和TGF-β1RⅡ在mRNA水平表达的变化; 2)采用Western-blot方法进一步验证检测SM22α、和TGF-β1在蛋白水平的表达变化;研究结果:1.成功培养大鼠血管外膜成纤维细胞:细胞呈梭形或不规则的四边形,经形态学和免疫学鉴定波形蛋白免疫细胞化学染色为阳性,结蛋白及第Ⅷ因子染色为阴性,结合阴性对照,可判定所培养细胞为血管外膜成纤维细胞;2.细胞水平研究: 1)细胞存活率的改变:MTT实验显示当剂量为100μg/mL时,细胞存活率为41.0%,显著低于对照组(72.3%),细胞存活率差异有显著性(p<0.05);WST-1实验显示当剂量为50μg/mL时,细胞存活率为51.2%,显著低于对照组(77.2%),细胞存活率差异有显著性(p<0.05)。2)氧化损伤:GSH:当剂量为3.2μg/mL时,GSH含量为0.73 U/mg prot,显著低于对照组(0.90 U/mg prot),差异具有显著性,(p<0.05);SOD:当剂量为12.5μg/mL时,SOD活性为9.61 U/mg prot,显著低于对照组(14.24 U/mg prot),差异具有显著性p<0.05;MDA:在剂量为3.2μg/mL时,MDA含量为0.30 nmol/mg prot,显著高于对照组(0.23 nmol/mg prot),差异具有显著性p<0.05。3)细胞超微结构的改变:透射电镜结构显示,SWCNTs能穿透细胞膜进入细胞质并聚集,进而对细胞造成损伤。在50μg/mL剂量暴露24h组表现为细胞水肿,有些已坏死,细胞膜不完整,胞核缩小,内质网扩张,其中还可见絮状物,线粒体变大变圆,基质变浅,嵴变短变少甚至消失。有些线粒体转化为小空泡状结构,高尔基体受损,出现扁平囊的扩张和扁平囊,大泡和小泡的崩解。3.分子水平研究1)实时荧光定量PCR检测细胞内SM22α、TGF-β1和TGF-βRⅡ在mRNA水平表达变化:经SWCNTs暴露的血管外膜成纤维细胞与对照组相比,SM22α表达量均下降,而TGF-β1和TGF-βRⅡ的表达量均上调。2) Western-blot方法验证检测SM22α、TGF-β1和TGF-βRⅡ在蛋白水平的表达变化:经SWCNTs暴露的血管外膜成纤维细胞与对照组相比,SM22α和TGF-β1的表达量均上调,且TGF-β1表达量呈剂量效应关系,随着染毒剂量的增加,TGF-β1的表达量也随之增加。研究结论:1.细胞水平试验结果表明,SWCNTs暴露可致大鼠血管外膜成纤维细胞损伤。表现为细胞存活率下降和超微结构的改变,细胞出现氧化应激现象。2.分子水平试验表明,SM22α的表达受TGF-β1信号传导通路的调控,SWCNTs暴露可激活TGF-β1信号传导通路,使细胞内表达SM22α蛋白,促使血管外膜成纤维细胞转化为肌成纤维细胞,并通过增殖、穿越基底层向中膜和内膜下迁移,使血管组织发生重构。

全文目录

缩略语  5-7
摘要  7-11
英文摘要  11-15
前言  15-18
第一部分原代培养大鼠血管外膜成纤维细胞及其鉴定  18-24
  1 材料与方法  18-20
    1.1 试验材料  18-19
    1.2 实验方法  19-20
  2 结果  20-21
    2.1 原代细胞取材及培养  20
    2.2 形态学鉴定  20-21
    2.3 免疫学鉴定  21
  3 讨论  21-23
  4 小结  23-24
第二部分 SWCNTs 对大鼠血管外膜成纤维细胞的毒性作用  24-34
  1 材料与方法  24-27
    1.1 试验材料  24-25
    1.2 方法  25-27
  2 结果  27-31
    2.1 单壁碳纳米管的混悬表征  27
    2.2 单壁碳纳米管对血管外膜成纤维细胞活性的影响  27
    2.3 细胞内GSH含量  27-28
    2.4 细胞的SOD活性  28-29
    2.5 细胞内MDA含量  29
    2.6 单壁碳纳米管对血管外膜成纤维细胞超微结构的损伤  29-31
  3 讨论  31-33
  4 结论  33-34
第三部分 SM22α蛋白在SWCNTs致血管外膜成纤维细胞损伤中的分子机理的初步探讨  34-45
  1 材料与方法  34-40
    1.1 试验材料  34-35
    1.2 试验方法  35-40
  2 结果  40-42
    2.1 β-actin 、SM22α、TGF-β1、TGF-β1RⅡ引物的特异性检测  40
    2.2 VAF细胞中SM22α、TGF-β1、TGF-β1RⅡm RNA表达变化  40-41
    2.3 VAF细胞中SM22α、TGF-β1蛋白表达变化  41-42
  3 讨论  42-45
结论  45-46
参考文献  46-50
附录  50-52
文献综述  52-60
  参考文献  58-60
发表论文  60-67
个人简历  67-68
致谢  68

SM_(22α)蛋白在调控单壁碳纳米管诱导血管外膜成纤维细胞转化中的作用及其机理

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