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多靶点酪氨酸激酶抑制剂ZD6474通过NF-κB通路抑制卵巢癌中IL-8的表达

作　者: 孙远旭
导　师: 王长智
学　校: 大连医科大学
专　业: 妇产科学
关键词: 卵巢癌 ZD6474 NF-κB IL-8
分类号: R737.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


目的：IL-8是促血管生成因子能够促进肿瘤血管生成，与肿瘤的生长、转移有着密切关系，临床研究发现高表达IL-8的卵巢癌患者愈后较差。核因子-κB(Nuclearfactor-κB)是参与细胞增殖、凋亡调控、免疫应答、炎症反应以及肿瘤发生发展转移的重要转录因子，也是激活IL-8表达的重要转录因子。近年来多靶点酪氨酸激酶抑制剂充分显示了广谱的抗瘤效果而在肿瘤治疗领域备受关注。ZD6474是其中的一个代表。ZD6474可同时抑制VEGFR2和EGFR酪氨酸激酶双靶点，具有广谱的抗血管生成作用。本研究通过ZD6474处理卵巢癌细胞株SKOV3，检测ZD6474对卵巢癌细胞株SKOV3中IL-8的表达调控，并深入研究ZD6474对IL-8的下调作用与NF-κB通路的相关性。为开发新的卵巢癌治疗策略提供实验基础。方法：1.采用MTT法检测ZD6474对卵巢癌细胞株SKOV3增殖的影响。2.采用RT-PCR的方法在基因水平检测经过ZD6474处理的卵巢癌细胞株SKOV3中对IL-8表达的影响。3采用ELISA的方法在蛋白水平检测ZD6474对IL-8的表达调控。4.采用双荧光素酶报告系统检测ZD6474对IL-8的表达调控与NF-κB是否有关。结果：1. ZD6474对卵巢癌细胞株SKOV3的增殖抑制作用，实验采用不同剂量的ZD6474处理卵巢癌细胞株SKOV360h，结果表明ZD6474可显著抑制卵巢癌细胞SKOV3的增殖，且ZD6474的浓度取2umol/L已达到50%的抑制率。2.我们在基因水平检测ZD6474是否会影响IL-8的表达。分别用0,0.1,1,2umol/L的ZD6474处理卵巢癌细胞株SKOV36h，实时定量PCR (Real-Time PCR)检测IL-8的mRNA表达水平。结果显示，当ZD6474浓度为1μmol/L时，可显著抑制IL-8的mRNA表达（P<0.05）。3.在蛋白水平检测ZD6474对IL-8的表达调控。卵巢癌细胞株SKOV3用含不同浓度ZD6474无血清培液培养过夜，用10ng/mLTNF-α处理8h， ELISA检测培养上清中IL-8的表达水平。所得结果与Teal-time PCR一致。4.采用双荧光素酶检测ZD6474对IL-8的负调控是否与NF-κB有关，分别将野生型IL-8基因上游转录调控区及NF-κB结合位点缺失的转录调控区克隆到荧光素酶报告基因的上游，构建成p-IL-8-luc及p-IL-8(ΔNF-κB)-luc报告系统。将上述两质粒分别与pRL-TK-luc（内参）共转SKOV3，24h后细胞换含不同浓度ZD6474无血清培养基培养过夜，然后用10ng/ml TNF-α处理6h，双荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶的表达水平结果显示，ZD6474可抑制野生型IL-8启动子(p-IL-8-luc)序列介导的荧光素酶的表达（P<0.05），而对缺失NF-κB结合位点的突变的IL-8启动子(p-IL-8((ΔNF-κB)-luc)序列介导的荧光素酶表达则无抑制效果。该结果表明ZD6474通过NF-κB途径实现对IL-8的负调控。并利用的p-NF-κB-luc荧光素酶报告系统，检测ZD6474对NF-κB的活性调控作用。结果显示：ZD6474可有效抑制TNF-α诱导的NF-κB的活化。结论：ZD6474可抑制卵巢癌细胞株的增殖。该抑制作用可能与ZD6474对NF-κB的活性抑制，及其对IL-8的表达下调有关。该研究表明对于IL-8高表达的卵巢癌，ZD6474有望取得更好的治疗效果。

全文目录


中文摘要  7-9
Abstract  9-12
前言  12-14
材料与方法  14-16
  1. 实验材料  14-15
    1.1 实验试剂  14-15
    1.2 实验设备  15
  2. 方法  15-16
    2.1 胞培养、转染及 ZD6474 药物处理  15
    2.2 MTT 检测  15-16
    2.3 实时定量 PCRReal Time-PCR  16
    2.4 ELISA  16
    2.5 双荧光素酶检测  16
  3. 统计分析  16
结果  16-24
  1. ZD6474 抑制卵巢癌细胞株 SKOV3 的增殖  16-17
  2. ZD6474 分别在基因及蛋白水平抑制 IL-8 表达  17-20
  3. ZD6474 对 IL-8 的抑制与 NF-κB 有关  20-22
  4. ZD6474 抑制 NF-κB 活性  22-24
讨论  24-31
  1. 抗血管生成的肿瘤治疗的研究进展  24-25
  2. ZD6474 可选择性抑制 VEGFR2 及 EGFR 双靶点遏制肿瘤生长  25-27
  3. IL-8 在卵巢发生发展中有重要作用  27
  4. 结果分析  27-31
结论  31-32
参考文献  32-35
综述  35-44
  参考文献  42-44
致谢  44-45

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 泌尿生殖器肿瘤 > 女性生殖器肿瘤 > 卵巢肿瘤
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