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肿瘤坏死因子α在骨关节炎细胞凋亡及明胶酶表达的机制研究

作　者: 李德岭
导　师: 邱贵兴
学　校: 北京协和医学院
专　业: 临床医学
关键词: 肿瘤坏死因子α 软骨细胞滑膜细胞调亡明胶酶
分类号: R684.3
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的分析膝骨关节炎病人的病变软骨细胞调亡的存在,及在TNFα刺激下细胞调亡及明胶酶(基质金属蛋白酶--MMP-2, MMP-9)活性的变化,着重探讨决定软骨细胞凋亡的信号通路,比较同等条件刺激下滑膜细胞与软骨细胞凋亡命运的区别。方法从骨关节炎(OA)病人行全膝关节置换术(TKA)中切除的软骨及滑膜组织中,将切削、消化后的软骨及滑膜细胞进行培养,取原代细胞进行后续研究。人重组’TNFα单独刺激及和其通路上不同蛋白的抑制因子联合刺激,收集细胞后,行Annexin V-FTTC及PI双染后进行流式细胞仪检测凋亡,同时裂解细胞、提取蛋白行Western blot检测caspase-3和PARP的激活情况；收集细胞培养上清,行明胶酶谱分析以检测MMP-2和MMP-9的活性变化。结果OA软骨细胞表达激活形式的caspase-3和PARP,提示其具有调亡背景。170ng/m人重组TNFα单独刺激,不能增加软骨细胞调亡。抑制PI3K (10uM LY294002)或NF-κB (1nM CAPE)后,联合TNFα刺激可增加软骨细胞调亡,调亡抑制因子c-FLIP表达下调。抑制MEK1/2(10uM U0126)或mTOR (10nM Rapamycin),联合TNFα刺激不能增加软骨细胞调亡。相反地,同样刺激条件下,即NF-κB抑制剂(1nM CAPE)联合170ng/mlTNFα刺激后,滑膜细胞的调亡较对照组及单药刺激组反而减少。170ng/ml TNFα可显著性地增加软骨细胞培养上清内的酶原MMP-9、激活MMP-9、酶原MMP-2和激活MMP-2的表达。抑制NF-κB (1nM CAPE)能显著性抑制TNFα诱导的酶原MMP-9的增加。细胞培养上清中激活MMP-9与总MMP-9的比值随时间而增大,钙离子可延缓但不能阻止该进程。相比于200umol/L和10umol/L的钙离子浓度,关节腔内生理浓度2.5mmol/L可发挥最大作用。提示OA软骨细胞分泌的酶原MMP-9存在自激活现象,关节腔内钙离子对MMP-9的基质降解可能起到暂时保护的作用。结论1. PI3K-NF-κB通路,而不是PI3K-mTOR或MEK1/2通路能保护软骨细胞免受TNFa引起的调亡,c-FLIP发挥重要作用。2.同等浓度TNFα和同等程度NF-κB抑制下,滑膜细胞和软骨细胞抵抗调亡的特性不一样。总之,阻断或抑制NF-κB,可能在抑制滑膜细胞调亡、抑制软骨分泌MMP9方面有利于延缓疾病进展,但需高度警惕软骨细胞调亡,注意其长期副作用。

全文目录

中文摘要  4-5
Abstract  5-6
前言  6-13
  本研究釆用的实验路线:  10-11
  参考文献  11-13
第一部分 TNFα炎症因子与关节软骨、滑膜细胞凋亡的关系及通路研究  13-38
  材料与方法  14-20
  结果  20-30
  讨论  30-35
  参考文献  35-38
第二部分软骨细胞在TNFα刺激下形成基质降解的研究  38-57
  材料与方法  39-44
  结果  44-50
  讨论  50-54
  参考文献  54-57
全文总结  57-58
附录1. 英文缩略语表  58-60
附录2. 主要试剂配方  60-62
综述骨关节炎与调亡事件的研究进展  62-68
  参考文献  66-68
博士研究生期间已发表论文和参会论文  68-69
个人简历  69-70
致谢  70

肿瘤坏死因子α在骨关节炎细胞凋亡及明胶酶表达的机制研究

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