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CHD5对乳腺癌细胞生长和浸润过程的抑制作用及其机制研究

作　者: 吴晓
导　师: 董金堂
学　校: 南开大学
专　业: 遗传学
关键词: CHD5 甲基化突变表达乳腺癌
分类号: R737.9
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

研究背景：癌症是一种严重影响公众健康的疾病，而乳腺癌则是女性中最常见的癌症。据统计，美国2011年新增乳腺癌病理230,480例，占新发癌症总数的30%，死亡39,520例，占总死亡数的15%。近年来，我国乳腺癌发病率逐年上升，已跃升为一些大城市女性肿瘤的第一位，并呈现年轻化的趋势。由此可见，乳腺癌的预防、治疗及研究是迫在眉睫的任务。研究乳腺癌相关发病基因及其作用机理，是寻找新的诊断及治疗靶点的一个重要方面。染色质重塑及DNA解旋酶蛋白5（chromodomain helicase DNA bindingprotein5，CHD5）是2003年发现的一个新基因。Bagchi等人对小鼠模型的研究证实，Chd5基因可以促进小鼠细胞凋亡，抑制细胞增殖及转化，从而发挥抑癌基因的功能。此外，CHD5基因所在的人类染色体1p36区，在多种癌症包括乳腺癌中均发生缺失，提示CHD5在乳腺癌的发生及进展过程中可能也发挥抑癌基因的功能。研究内容：我们运用RCR扩增及测序的方法检测了55个乳腺癌样品中CHD5基因编码区及外显子两侧剪切位点的突变情况；运用实时定量PCR（real-time PCR）的方法检测了44个乳腺癌样品中CHD5基因拷贝数的变化情况；运用亚硫酸氢钠处理及克隆测序的方法检测了39个乳腺癌样品中CHD5基因启动子区的甲基化情况；分别运用实时定量PCR及免疫组织化学染色（immunohistochemical (IHC) staining）的方法检测了90个乳腺癌样品中CHD5基因mRNA的表达以及289个乳腺癌样品中CHD5蛋白的表达变化。此外，我们通过细胞及动物实验，研究了CHD5基因在体外及体内对细胞增殖的影响，及其在体外对细胞浸润的影响。并初步探讨了乳腺癌中CHD5发挥其功能的分子机制。研究结果：CHD5基因在乳腺癌中很少发生突变，我们只在MDA-MB-231乳腺癌细胞系中检测到一个移码突变，该突变位于CHD5染色质解旋酶/ATP酶结构域。CHD5基因拷贝数有频繁的半合性缺失，而且其基因启动子区频繁发生高甲基化，导致乳腺癌样品中CHD5mRNA表达水平显著下降。去甲基化试剂处理可显著增加CHD5mRNA在乳腺癌细胞系中的表达。乳腺癌临床样本中，CHD5mRNA表达下调和淋巴结转移显著相关（P=0.026）。免疫组化分析显示，CHD5蛋白表达水平在乳腺癌样本中显著降低，而且其表达下调和肿瘤高组织学级别（histological grade）、雌激素/孕激素阴性（ER/PR-negative）、HER2阳性（HER2-positive）以及乳腺癌远端转移呈显著相关（P≤0.01）。此外，CHD5表达下调或缺失的病人，其无病生存率（progression-free survival）及总生存率（overall survival）均显著下降。从功能方面来看，CHD5可以抑制MDA-MB-231及Hs578T乳腺癌细胞在体外的增殖，减慢细胞周期进程，并可抑制MDA-MB-231细胞在裸鼠体内的成瘤。CHD5还可抑制MDA-MB-231及Hs578T乳腺癌细胞的浸润能力，并下调间质细胞标志物Vimentin、N-cadherin及ZEB1的表达。CHD5对乳腺癌细胞恶性行为（过度增殖及浸润等）的调节可能是通过其对microRNA-192的调控来实现的。结论：我们的研究结果表明，CHD5基因在乳腺癌中发挥了抑癌基因的功能。启动子区的高甲基化及CHD5所在染色体区域半合性缺失是导致其表达下调的主要机制。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-9
目录  9-13
缩略词  13-14
第一章引言  14-38
  第一节乳腺癌概述  14-18
    1.1.1 乳腺的发育  14
    1.1.2 乳腺的结构和功能  14-16
    1.1.3 乳腺癌的分类和诊断  16-17
    1.1.4 乳腺癌的发病机理及防治  17-18
  第二节癌变过程中的遗传机制  18-24
    1.2.1 染色体畸变与癌症  18-20
    1.2.2 染色体 1p36 区与癌症  20-21
    1.2.3 基因突变与癌症  21-24
  第三节癌变过程中的表观遗传机制  24-30
    1.3.1 表观遗传机制  24-26
    1.3.2 DNA 甲基化与癌症  26-27
    1.3.3 表观遗传药物  27-30
  第四节 ATP 依赖性染色质重塑解旋酶  30-36
    1.4.1 染色质重塑解旋酶分类  30-32
    1.4.2 CHD 家族及其在发育与癌变过程中的作用  32-35
    1.4.3 CHD5 在癌变过程中的作用  35-36
  第五节研究的意义  36-38
第二章研究目标  38-39
第三章材料与方法  39-59
  第一节实验材料  39-42
    3.1.1 细胞系  39
    3.1.2 样本  39
    3.1.3 质粒  39-40
    3.1.4 菌株  40
    3.1.5 小鼠  40
    3.1.6 引物  40
    3.1.7 主要试剂及试剂盒  40-42
    3.1.8 抗体  42
    3.1.9 小干扰 RNA（siRNA）  42
  第二节实验方法  42-59
    3.2.1 DNA 提取  42-43
    3.2.2 RNA 提取  43-45
    3.2.3 基因突变检测  45-46
    3.2.4 基因拷贝数检测  46-47
    3.2.5 mRNA 表达量检测  47-48
    3.2.6 免疫组化（IHC）  48-49
    3.2.7 启动子区 DNA 甲基化检测  49-51
    3.2.8 Western blotting  51-52
    3.2.9 细胞培养及转染  52-53
    3.2.10 转基因多克隆细胞系筛选  53-54
    3.2.11 转基因单克隆细胞系筛选  54
    3.2.12 SRB 体外细胞增殖实验  54-55
    3.2.13 流式细胞仪测细胞周期  55
    3.2.14 浸润实验（transwell）  55-56
    3.2.15 裸鼠成瘤实验  56
    3.2.16 启动子活性检测  56-57
    3.2.17 MicroRNA 表达检测  57
    3.2.18 统计分析  57-59
第四章结果  59-91
  第一节乳腺癌中 CHD5 基因突变及拷贝数检测  59-63
    4.1.1 乳腺癌中 CHD5 基因突变情况  59-61
    4.1.2 乳腺癌中 CHD5 基因拷贝数变异情况  61-62
    4.1.3 小结  62-63
  第二节乳腺癌中 CHD5 基因表达检测  63-73
    4.2.1 乳腺癌中 CHD5 基因 mRNA 表达检测  63-66
    4.2.2 乳腺癌中 CHD5 蛋白表达检测  66-68
    4.2.3 CHD5 表达变化与临床病理指标的相关性分析  68-72
    4.2.4 小结  72-73
  第三节乳腺癌中 CHD5 基因启动子区 DNA 甲基化检测  73-80
    4.3.1 乳腺癌中 CHD5 启动子区甲基化水平  73-76
    4.3.2 CHD5 启动子区甲基化与其 mRNA 表达的关系  76-78
    4.3.3 去甲基化试剂处理可上调 CHD5 表达  78-79
    4.3.4 小结  79-80
  第四节 CHD5 对乳腺癌细胞增殖及浸润的调控  80-91
    4.4.1 CHD5 抑制乳腺癌细胞体外增殖  80-83
    4.4.2 CHD5 抑制乳腺癌细胞体内成瘤  83-84
    4.4.3 CHD5 抑制乳腺癌细胞浸润  84-86
    4.4.4 CHD5 调节 microRNA-192 表达  86-89
    4.4.5 小结  89-91
第五章讨论  91-98
  第一节 CHD5 基因突变与乳腺癌  91-92
  第二节 CHD5 基因 mRNA 及蛋白表达与乳腺癌  92-94
  第三节 CHD5 启动子高甲基化与乳腺癌  94-95
  第四节 CHD5 与乳腺癌细胞的增殖及浸润  95-98
第六章结论与展望  98-100
  第一节结论  98-99
  第二节展望  99-100
参考文献  100-109
致谢  109-111
附录  111-114
  附录 A CHD5 基因突变检测引物  111-113
  附录 B WHO 对乳腺癌的组织学分类  113-114
个人简历、在学期间发表的学术论文及研究成果  114-115

CHD5对乳腺癌细胞生长和浸润过程的抑制作用及其机制研究

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