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磷酸化FoxO1在高糖诱导人肾小管上皮细胞脂质沉积中的作用

作　者: 李凡
导　师: 段惠军
学　校: 河北医科大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 糖尿病脂质沉积人肾小管上皮细胞叉头框蛋白O1 质粒转染脂肪分化相关蛋白脂肪酸合成酶
分类号: R587.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

目的：糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病的慢性微血管并发症之一，超过30％的终末期肾功能衰竭是由糖尿病所致。糖尿病肾病在病理学上主要表现为肾小球系膜细胞肥大、细胞外基质分泌、肾小球硬化、肾小管上皮细胞转分化、肾小管间质纤维化和足细胞凋亡等，其发病机制涉及到许多方面，包括高血糖、高血流灌注、炎症因子、免疫损伤、氧化应激和血脂异常等。有学者认为肾脏固有细胞脂质合成的增多导致肾脏内脂质积聚在糖尿病肾病的发生发展中发挥着重要作用。本研究室前期实验证实高糖刺激人肾小管上皮细胞，可通过激活PI3K/Akt信号通路上调脂代谢相关蛋白ADRP和FAS的表达介导糖尿病肾脏脂质积聚，而应用PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002阻断Akt激活后，细胞内脂滴形成明显减少，提示PI3K/Akt通路参与了糖尿病肾小管上皮细胞的脂质沉积，然而PI3K/Akt通路调控糖尿病肾脏脂质沉积的具体机制尚未完全阐明。PI3K/Akt通路下游有许多目标基因，包括Bad、FoxO1、mTOR、PRAS40和GSK-3β，其中叉头框蛋白1（forkhead transcription factors of Oclass1，FoxO1）广泛分布于机体的各类组织和细胞中，其上游主要受PI3K/Akt信号通路调控，活化的Akt可使FoxO1发生磷酸化由核内输出至胞浆而失去转录活性。有关FoxO1在糖尿病中的研究揭示高糖可刺激肾脏固有细胞PI3K/Akt信号通路激活，活化的Akt使FoxO1磷酸化，核内FoxO1减少。PI3K/Akt激酶抑制剂LY294002刺激细胞时FoxO1的亚细胞定位主要位于核内, FoxO1总蛋白水平没有显著的变化，磷酸化水平降低。提示FoxO1作为PI3K/Akt通路的下游因子参与了糖尿病的发生发展。但是目前有关FoxO1与糖尿病肾脏脂质沉积的关系鲜有报道。脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）是体内脂肪合成途径中的一个关键酶，催化乙酰辅酶A和丙二酰CoA合成内源性长链脂肪酸。脂肪分化相关蛋白（adipose differentiation-related protein，ADRP）是一种主要的脂滴蛋白，位于多种细胞脂滴表面，是脂滴的主要成分之一，在脂滴很小时可检测出ADRP的表达。油红O染色是公认的检测细胞内脂滴的方法，灵敏度较高。本实验以FAS和ADRP表达量的变化及油红O红染脂滴颗粒作为检测脂质代谢的变化。本研究通过高糖刺激体外培养的人肾小管细胞并转染野生型FoxO1质粒及Ser256位点发生突变的FoxO1质粒，观察FoxO1、p-FoxO1、ADRP蛋白表达量和FAS mRNA变化，初步探讨p-FoxO1与糖尿病肾小管上皮细胞脂质沉积的关系。方法：人肾小管上皮细胞（HK2）在37℃,5%CO2培养箱内用含10%的胎牛血清、100KU/L青霉素及100mg/L链霉素的DMEM培养基培养。①采用CaCl2法制备DH5a感受态细胞，FoxO1野生型重组质粒及256位点突变的FoxO1质粒转化感受态细胞，摇菌扩增后提取质粒。②细胞同步化后随机分为两组：正常对照组（5.5mmol/L葡萄糖）和高糖组（25mmol/L葡萄糖）。高糖刺激48小时后终止培养，分别进行蛋白质、RNA提取及油红O染色，Western blot检测FoxO1、p-FoxO1（Ser256）及ADRP蛋白表达；Real-time PCR检测细胞内FAS mRNA的表达；油红O观察细胞内脂滴变化。③野生型及突变型FoxO1质粒转染实验，细胞随机分为4组：空白细胞对照组、pcDNA3.1空质粒对照组、pcDNA3.1-wt FoxO1质粒转染组和pcDNA3.1-mutation FoxO1（S256A）质粒转染组。转染采用阳离子脂质体法，转染后高糖刺激48小时，采用Western blot检测FoxO1、p-FoxO1（Ser256）及ADRP蛋白表达；Real-time PCR检测细胞内FAS mRNA的表达；油红O观察细胞内脂滴变化。结果：1．高糖对人肾小管上皮细胞FoxO1、p-FoxO1、ADRP和FAS表达的影响Western blot检测显示正常对照组和高糖组HK2细胞总FoxO1表达未见明显差异，定量分析条带积分光密度比值分别为0.64±0.10和0.69±0.06；磷酸化FoxO1（即失活状态的FoxO1）在两组间表达不同，高糖组明显高于正常对照组，相对表达量分别为0.43±0.04和0.23±0.04，差异有统计学意义（P<0.05）；ADRP表达高糖组明显高于正常对照组，分别为0.66±0.22和1.19±0.20，差异有统计学意义（P<0.05）。应用Real-time PCR技术进行细胞内FAS mRNA表达的检测，高糖组表达明显高于正常对照组，是正常对照组的2.73倍。2.重组质粒pcDNA3.1-wt FoxO1转染对人肾小管上皮细胞脂质代谢的影响重组质粒pcDNA3.1-wt FoxO1转染48小时后总FoxO1蛋白明显上调，分别是空白对照组和空质粒对照组的1.69倍和1.67倍；重组质粒pcDNA3.1-wt FoxO1转染组细胞在高糖刺激下，p-FoxO1蛋白出现明显上调，经内参校对条带的积分光密度比为0.77±0.09，分别是空白对照组和空质粒对照组的1.91倍和2.00倍；高糖刺激下，pcDNA3.1-wt FoxO1质粒转染组ADRP表达量也明显升高，分别是空白对照组和空质粒对照组的1.56倍和1.57倍。Real-time PCR检测FAS mRNA表达，发现在pcDNA3.1-wt FoxO1重组质粒转染组细胞中，FAS mRNA表达量较对照组明显升高。采用油红O染色方法检测细胞内脂滴形成情况，pcDNA3.1-wt FoxO1重组质粒转染组较空白对照组出现更为清晰的红染脂滴颗粒。3．pcDNA3.1-mutation FoxO1（S256A）重组质粒转染人肾小管上皮细胞的表达和影响Western blot检测显示pcDNA3.1-mutation FoxO1（S256A）质粒转染48小时后总FoxO1蛋白较空白对照组明显升高，定量分析为1.05±0.31；p-FoxO1蛋白定量分析为0.34±0.03，与空白对照组相比减少17.4％；ADRP表达量也明显降低，条带积分光密度比值为0.73±0.14，与空白对照组相比降低31.8％。Real-time PCR结果显示pcDNA3.1-mutation FoxO1（S256A）质粒转染组细胞FAS mRNA表达下降，较空白对照组减少了36.5%。油红O染色方法显示pcDNA3.1-mutation FoxO1（S256A）重组质粒转染组细胞内红染脂滴颗粒与空白对照组相比数量减少。结论：1.高糖刺激下人肾小管上皮细胞磷酸化FoxO1蛋白表达上调，FASmRNA和ADRP蛋白表达增加并引起细胞内脂滴形成增多，提示磷酸化FoxO1可能参与了糖尿病肾小管上皮细胞的脂质沉积。2. pcDNA3.1-wt FoxO1重组质粒在高糖刺激下能够促进体外培养的人肾小管上皮细胞p-FoxO1表达，上调脂肪酸合成酶并引起细胞脂质合成增多。3. pcDNA3.1-mutation FoxO1（S256A）质粒转染的HK2细胞在高糖刺激下，细胞内脂质合成并未升高，避免了野生型FoxO1质粒引起的脂质合成增多，提示FoxO1磷酸位点Ser256发生突变，高糖刺激下FoxO1不能被磷酸化形成p-FoxO1，可能抑制了高糖刺激下肾小管上皮细胞的脂质合成。

全文目录

摘要  4-8
ABSTRACT  8-13
前言  13-14
材料与方法  14-22
结果  22-24
附图  24-31
附表  31-32
讨论  32-34
结论  34
参考文献  34-37
综述转录因子 FoxO1 与疾病的发生  37-47
  参考文献  42-47
致谢  47-48
个人简历  48

磷酸化FoxO1在高糖诱导人肾小管上皮细胞脂质沉积中的作用

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