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GATA-4基因促进5-氮杂胞苷诱导的骨髓间充质干细胞向心肌分化

作　者: 张亚楠
导　师: 张雷
学　校: 河北医科大学
专　业: 人体解剖与组织胚胎学
关键词: GATA-4 骨髓间充质干细胞心肌分化 pVP22-GATA-4/myc-His质粒转染 5-aza
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的:全世界每年都有数以万计的患者被诊断为“充血性心力衰竭(CHF)”[1] ,其中很大部分是由冠状动脉粥样硬化和心肌梗塞造成的,因此缺血性心脏病己成为危害人类健康的最主要疾病。人们普遍认为,成熟的心肌细胞是终末分化细胞,一旦损伤坏死后不能再生,心肌梗死(MI)后,即使通过一些临床治疗能够改善心肌缺血的症状,却不能逆转心肌细胞的坏死,最终将导致充血性心力衰竭的发生。而成体心脏中的心肌干细胞数量极少,起不到修复的作用;加上心脏移植疗法供体稀缺、免疫源性高和费用昂贵的限制,因此,现在许多研究者把目光投向干细胞移植治疗技术。大量研究表明,可以通过细胞移植术,使干细胞在瘢痕组织内分化成为有功能的心肌细胞来替代坏死的心肌,进而改善心功能。但是关于细胞移植还存在许多难题,首先就是用于移植的干细胞向心肌细胞的分化效率低,达不到临床移植所需的数量。因此研究干细胞向心肌细胞分化时的具体机制是极具意义的一项课题。骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)易于从自体获取,回植后不会发生免疫排斥反应;在体外易进行分离、培养和扩增,并可长时间在体外保持未分化状态,具有多向分化潜能:其在特定的条件下可向肌腱细胞、骨细胞、软骨细胞等方向分化,且体外易进行外源性基因加工,因此BMSCs是组织工程中较为理想的种子细胞。众多学者认为,心肌分化的过程始于某个或某些关键基因的启动,这些基因活化后的蛋白产物,即转录因子可以使下游相应的靶基因呈级联式地激活,直至分化完成。其中,GATA-4被认为和心脏发育尤为密切。它开始表达于心脏早期,参与心脏前体细胞的分化,房室分隔,心脏的环化,传导系统的发育及成熟心脏正常功能的维持。研究表明, GATA-4可能是通过其锌指结构与Nkx2-5、TBX5、dHAND和MEF2等心脏特异性的转录因子相互作用形成复合物,发挥调节作用。或通过调控包括心脏肌球蛋白重链-α(α-myosin heavy chain,α-MHC)、心肌钙蛋白C(cardiac troponin C, cTnC)、心房利钠肽(atrial natriureticp ep tide,ANP)和脑利钠肽(brain natriureticp ep tide,BNP)等在内的心脏结构基因的表达,发挥转录调控作用。GATA-4缺失或突变可引起心血管系统发育的异常。GATA-4能够阻止药物诱导的心肌细胞凋亡的发生并能够降低药物引起的心肌毒性,因此它对心肌细胞的正常存活也有一定的作用。细胞穿透肽(cell-penetrating protein,CPP),是一种已被证实能够通过蛋白质转导的方法穿透细胞膜到达细胞核,并且能够保留其生物学活性的蛋白质。在体内及体外实验中,CPP已成功地帮助蛋白质、多肽、DNA和siRNA等大分子生物活性物质传递到细胞内,VP22即为CPP中的一种。由于CPP不受细胞种类的限制,并且传递效率高,因此CPP常用于在不同组织间传递大分子量的生物活性蛋白。研究表明,CPP的作用机制可能为,CPP拥有强大的阳离子特性(这是CPP必备的特征),使其对富含阴离子的细胞膜及核苷酸有强大的粘附作用,使其能够穿透细胞膜并凝集在细胞核中。迄今为止,CPP是唯一一种成功地在细胞间传递嵌合蛋白质的方法。由于脂质体转染法缺少靶向作用及低转化率,我们尝试借助VP22穿透肽的载体作用帮助GATA-4转染至BMSCs中。因此,本研究拟借助细胞穿透肽VP22的载体作用,利用脂质体转染法将GATA-4基因瞬时转染SD大鼠骨髓间充质干细胞,观察其在诱导剂5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-aza)的作用下向心肌分化的情况,并与单纯经5-aza诱导后的BMSCs向心肌细胞分化的情况作比较,以试图阐明心肌细胞分化过程中的一些规律,为干细胞能够有效转化为心肌细胞提供策略。方法:1 pVP22-GATA-4/myc-His真核表达质粒的转化、鉴定与扩增由美国Marc Penn博士惠赠的pVP22-GATA-4/myc-His质粒,经常规CaCl2法转化至大肠杆菌DH5α感受态细菌,涂布于含氨苄青霉素的固体LB培养基上,37℃倒置培养12～24 h;挑取单个克隆菌落,进行扩增。用质粒抽提试剂盒提取质粒并检测浓度,再经XbaI、EcoRI双酶切鉴定。2 SD大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离、纯化和扩增利用贴壁培养的方法从SD大鼠胫骨和股骨骨髓中分离纯化BMSCs。BMSCs培养于含有15%小牛血清浓度的L-DMEM完全培养基中,3d首次换液,以后3-4d换液一次,待细胞铺满培养瓶底时传代。取第三代BMSCs做后续试验。3 pVP22-GATA-4/myc-His真核表达质粒转染BMSCs转染之前通过预实验确定合适的细胞接种密度,转染最佳体系。本实验采用阳离子转染试剂Lipofectamine 2000将质粒GATA-4:VP22转染BMSCs,于转染后48h以免疫细胞化学、免疫印迹法检测GATA-4:VP22融合蛋白在BMSCs中的表达。4 5-氮胞苷诱导外源表达GATA-4的BMSCs向心肌分化本实验分为转染组、未转染组和空质粒组,转染组为5-aza诱导的瞬时转染GATA-4基因的BMSCs;未转染组为5-aza诱导的单纯培养的BMSCs;空质粒组为瞬时转染PcDNA 3.1空质粒的BMSCs。用10μmol/L浓度的5-aza分别对转染组和未转染组的细胞诱导24h。在诱导后的21、28d收集细胞,以免疫细胞化学、免疫印迹法检测GATA-4:VP22融合蛋白、GATA-4蛋白、心肌肌钙蛋白T(cTnT)在BMSCs中的表达。5统计学分析:采用SPSS13.0统计软件进行统计,所有数据用均数±标准差(x±s)表示,采用配对t检验的统计分析方法,检验水准取α=0.05,当P<0.05时认为有显著差异。结果:1成功筛选出pVP22-GATA-4/myc-His质粒并进行扩增,酶切鉴定结果显示:可获得约7500bp(未经酶切的质粒)和1300bp(经酶切后的目的基因片段)两条条带,与质粒构建图一致。2原代培养中,细胞是以克隆集落的方式增殖。接种后可见圆形、折光性较强的BMSCs散在分布,其间夹杂大量血细胞。24h后,少量BMSCs开始贴壁,刚贴壁的BMSCs仍保持圆形。72h后,大多数细胞已贴壁,贴壁细胞伸展呈多角形。未贴壁的细胞通过多次换液被清除。3-4d可见小的集落形成,7-14d,相邻集落汇合成片达80%以上,细胞基本形态大致分为三种:纺锤样成纤维形、小圆形和多角形。传代后,细胞于2-4h开始贴壁,24h内完全贴壁,形态与原代细胞相似,3-5d汇合成片。第3代以后,细胞形态开始呈比较均一的成纤维状,细胞排列呈明显的漩涡状、辐射状。3实验确定,转染细胞传代密度:2×10~6/cm~2;转染的最佳体系:采用质粒DNA(μg)和转染试剂Lipofectamine 2000(μl)1:2.5的比率转染。48h后用免疫细胞化学、免疫印迹法检测到转染组GATA-4:VP22融合蛋白在BMSCs中有表达,未转染组和空质粒组无阳性表达。4细胞培养21、28d后,转染组与未转染组用免疫细胞化学、免疫印迹法均可分别检测到GATA-4蛋白、心肌肌钙蛋白T(cTnT)在BMSCs中的表达,且28d表达量比21d表达量高,两个时间点相比有显著性差异(P<0.05)。转染组与未转染组相比,在21、28d两个时间点,转染组GATA-4、cTnT两个基因的表达量均比未转染组高。统计分析结果显示:转染组21d、28d时GATA-4和cTnT的表达量均高于未转染组,两者相比有显著差异(P<0.01或P<0.05)。空质粒组无阳性表达。5转染组21d、28d的细胞经免疫印迹法测定,仍可表达GATA-4:VP22,未转染组和空质粒组无表达。结论:1在5-aza诱导条件下,外源转染表达GATA-4基因的BMSCs向心肌分化的情况优于未转染的BMSCs细胞,说明转录因子GATA-4可以促进BMSCs向心肌分化。2 5-aza诱导的外源性表达GATA-4基因的BMSCs可以向心肌分化,在蛋白水平表达心肌标志物和早期转录因子,且表达量随培养天数增加而逐渐增高。

全文目录

中文摘要  4-8
英文摘要  8-13
前言  13
材料与方法  13-26
结果  26-30
附图  30-44
附表  44-46
讨论  46-50
结论  50
参考文献  50-53
综述骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的研究进展  53-65
  参考文献  60-65
致谢  65-66
个人简历  66

GATA-4基因促进5-氮杂胞苷诱导的骨髓间充质干细胞向心肌分化

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