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FABP4表达变化在Hcy诱导THP-1单核细胞源性巨噬细胞胆固醇聚积中的作用及其机制的研究

作　者: 梁宇
导　师: 姜怡邓
学　校: 宁夏医科大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 同型半胱氨酸 THP-1单核细胞源性巨噬细胞 DNA甲基化脂肪酸结合蛋白4
分类号: R543.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的同型半胱氨酸血症(homocysteinemia, Hcy)已被公认为是致动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)的独立危险因子。本课题探讨同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)及其拮抗剂叶酸(folic acid, FA)、维生素B12(vitamin B12,VB12)干预下, THP-1单核细胞源性巨噬细胞内脂代谢相关基因脂肪酸结合蛋白4(fatty acid binding protein4, FABP4)mRNA、蛋白表达的变化和FABP4DNA甲基化水平的改变,及对总胆固醇(total cholesterol, TC)、氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, ox-LDL)、内质网应激相关蛋白含量的影响,明确Hcy对THP-1单核细胞源性巨噬细胞形成中FABP4表达及其DNA甲基化调控的影响。通过对FABP4基因采用基因重组技术对调控通路关键靶点进行干预,深入观察FABP4对THP-1巨噬细胞内脂质积聚的影响。为FABP4及其DNA甲基化对动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)的早期分子诊断及防治提供新的理论依据,也为检验医学的发展提供一个崭新的视角。方法培养THP-1单核细胞,以4×106个接种于25cm2培养瓶,加入5ml含500nM佛波酯(phorbol12-myristate13-acetate, PMA)的培养液,37℃、5%CO2培养48h,显微镜下观察显示此时细胞形状不规则并有伪足伸出,呈贴壁状态,证实其已分化为巨噬细胞,弃去旧培养液并用pH7.4的磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline, PBS)冲洗2-3遍,更换为含50、100、200、500MHcy、100M Hcy+叶酸(FA)+维生素B12(VB12)的15%胎牛血清的RPMI-1640培养基作为实验组,培养24h,以不加Hcy组(0M Hcy)为对照组,并设置pcDNA3.1-EGFP空质粒转染组和FABP4基因重组质粒转染组。采用荧光定量PCR(quantitative RT-PCR, qRT-PCR)和Western blotting检测FABP4mRNA和蛋白的表达;常规提取DNA,采用巢式降落式甲基化特异性PCR(nestedtouchdown methylation-specific PCR, ntMS-PCR)检测FABP4基因DNA甲基化改变;试剂盒酶法检测细胞中总胆固醇含量的变化;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测氧化低密度脂蛋白及内质网应激相关指标葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein78, GRP78)、X盒结合蛋白1(X-box binding protein1, XBP1)、 CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding proteinhomologous protein, CHOP)含量的变化。结果1.成功建立了THP-1单核细胞源性巨噬细胞模型,显微镜下观察显示其呈贴壁状态,形状不规则并有伪足伸出的巨噬细胞。2. Hcy干预后, ELISA检测结果显示巨噬细胞内GRP78、 XBP1、 CHOP和ox-LDL的含量明显增加,但与Hcy浓度不呈量效关系,实验组与对照组比较,有显著性差异(P<0.05),其中以100M Hcy组最明显,而100+FA+VB12组,巨噬细胞内GRP78、XBP1、CHOP和ox-LDL的含量又有所减少。3. Hcy干预后,巨噬细胞内TC含量明显升高,实验组与对照组比较,有显著性差异(P<0.05),同样,与Hcy浓度不呈量效关系,尤其是以100M Hcy组最明显,有非常显著性差异(P<0.01),说明Hcy减少了THP-1巨噬细胞内胆固醇的流出,巨噬细胞内胆固醇的积聚明显增加。4.荧光定量PCR结果显示: FABP4mRNA表达上调,以100M Hcy组效应最明显(P<0.01); Western blotting检测FABP4蛋白的表达与其mRNA表达一致。5. ntMS-PCR检测FABP4基因DNA甲基化的结果显示:在Hcy干预后,50、100、200、500M Hcy组与对照组(0M Hcy)相比较, FABP4基因DNA甲基化程度分别降低了17.97％、30.47％、18.69％和18.63％,以100M Hcy组差异最明显(P<0.01),而100+FA+VB12与100M Hcy组相比较, FABP4基因DNA甲基化程度反而增加了34.28％(P<0.01)。6.构建重组FABP4基因荧光真核表达载体并转染THP-1巨噬细胞,用荧光定量PCR和Western blotting检测FABP4mRNA和蛋白的表达,结果显示:与对照组比较, FABP4重组质粒转染组的FABP4mRNA和蛋白表达水平均明显升高(P<0.01),鉴定FABP4重组载体构建和转染成功。7. FABP4重组质粒转染巨噬细胞后,巨噬细胞胞内胆固醇的聚积明显增加,FABP4重组转染组与对照组比较,有显著性差异(P<0.01),说明FABP4减少了巨噬细胞内胆固醇的流出,使巨噬细胞内TC的含量明显增加。结论在THP-1单核细胞源性巨噬细胞中, Hcy可以引起内质网应激相关蛋白GRP78、XBP1、CHOP的上调,还可以促进TC和ox-LDL的升高。同时, Hcy通过促使甲硫氨酸循环紊乱,引起了在脂代谢过程中促进脂质堆积的FABP4基因DNA甲基化程度下降,使得FABP4mRNA和蛋白表达上调,进而增加了胆固醇在巨噬细胞内的积聚,在促进AS的发生发展中起了重要作用。

全文目录

摘要  4-7
ABSTRACT  7-15
前言  15-23
  参考文献  20-23
第一部分 HCY 诱导 THP-1 单核细胞源性巨噬细胞胆固醇聚积过程中 FABP4 表达变化及其 DNA 甲基化作用机制的研究  23-53
  引言  23-25
  材料与方法  25-42
  结果  42-48
  讨论  48-51
  参考文献  51-53
第二部分 FABP4 基因重组质粒的构建并转染 THP-1 单核细胞源性巨噬细胞及其对细胞内胆固醇聚积的影响  53-65
  引言  53-54
  材料与方法  54-58
  结果  58-62
  讨论  62-63
  参考文献  63-65
全文总结  65-67
综述  67-77
  综述参考文献  74-77
致谢  77-78
攻读学位期间发表的学术论文  78-79
个人简历  79

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