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EC-SOD DNA甲基化在高同型半胱氨酸血症致ApoE~(-/-)鼠动脉粥样硬化中的作用及调控机制研究

作　者: 孙炜炜
导　师: 姜怡邓
学　校: 宁夏医科大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 动脉粥样硬化 同型半胱氨酸 细胞外超氧化物歧化酶 DNA甲基化 ApoE-/-鼠 THP-1单核细胞源性巨噬细胞
分类号: R543.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


目的研究EC-SOD DNA甲基化水平改变在高同型半胱氨酸血症（Hyperhomo-cysteinemia, HHcy）致ApoE-/-小鼠动脉动脉粥样硬化（Atherosclerosis, AS）中的作用，并在THP-1单核细胞源性巨噬细胞水平上进一步探讨同型半胱氨酸（Homocysteine, Hcy）调控EC-SOD DNA甲基化水平改变的机制，明确Hcy对EC-SOD甲基化的作用及其调控机制，寻找Hcy引起EC-SOD甲基化改变的关键靶点，为预防和治疗HHcy引起的AS提供新的理论和实验依据。方法1.选择36只SPF级近交系C57BL/6J背景5周龄雄性纯合子ApoE-/-鼠，随机平均分为ApoE-/-鼠对照组，HHcy组和干预组，另选12只健康5周龄SPF级近交系C57BL/6J雄性小鼠喂食普通饲料作为正常对照组。喂养14周后，各组小鼠腹腔注射20%乌拉坦麻醉，摘除眼球取血分离血清，全自动生化分析仪测定血清Hcy和血脂水平；取主动脉进行石蜡包埋，切片，HE染色；分光光度比色法测定各组主动脉中总抗氧化能力（T-AOC）、超氧阴离子自由基（O2-·）、羟基自由基（OH·）、过氧化氢（H2O2）、丙二醛（MDA）含量的变化；采用实时荧光定量PCR（real-time PCR）法检测各组主动脉中细胞外超氧化物歧化酶（EC-SOD）和DNA甲基转移酶1（DNMT1） mRNA的表达；免疫荧光法检测各组主动脉中EC-SOD蛋白的表达；巢式降落式甲基化特异性PCR（ntMS-PCR）法检测EC-SOD DNA甲基化的改变；高效液相色谱法（HPLC）检测主动脉中S-腺苷甲硫氨酸（SAM）和S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）的浓度。2.体外培养THP-1单核细胞，以4×106个接种于25cm2细胞培养瓶中，加入含500nmol/L佛波酯（PMA）的R/MINI-1640培养液5mL，于37℃5%CO2培养箱中培养48h后，显微镜下观察此时细胞呈贴壁状态，细胞形态不规则且有伪足伸出，证实THP-1单核细胞已经分化为巨噬细胞。构建pEGFP-N1-DNMT1重组表达载体，采用脂质体转染巨噬细胞，荧光显微镜下观察重组载体在细胞中的表达情况，图像采集后，收集细胞，real-time PCR和Western blotting分别检测DNMT1mRNA和蛋白的表达；ntMS-PCR法检测EC-SOD DNA甲基化的改变。结果1. HHcy组血清Hcy和血脂水平显著高于正常对照组和ApoE-/-对照组（P<0.05,P<0.01）；切片HE染色光学显微镜下观察到HHcy组小鼠主动脉内膜明显增厚，形成明显的斑块，内皮下可见泡沫细胞积聚；HHcy组H2O2含量显著高于正常对照组和ApoE-/-对照组（P<0.01），T-AOC含量、抗O2-·活力单位、抑制OH·能力与对照组比较均降低（P<0.05, P<0.01），而干预组T-AOC、抗O2-·活力单位、抑制OH·能力较HHcy组升高，H2O2含量较HHcy组降低，差异有显著性（P<0.05, P<0.01）；HHcy组EC-SOD mRNA和蛋白表达与正常对照组和ApoE-/-组对照组比较均升高（P<0.05, P<0.01），而干预组其表达较HHcy组降低（P<0.05）；ntMS-PCR法检测HHcy组EC-SOD甲基化水平与正常对照组比较显著降低（P<0.01），叶酸和维生素B12干预后，EC-SOD甲基化水平增加，与HHcy组比较，差异有显著性（P<0.05）；real-time PCR检测HHcy组DNMT1mRNA的表达下调，与正常对照组和ApoE-/-对照组比较，分别下降了34.23%和27.53%，差异有显著性（P<0.05）；HPLC法检测SAM和SAH浓度结果显示，HHcy组和ApoE-/-对照组两者浓度均明显增加，与正常对照组比较，有非常显著性差异（P<0.01）。2.成功构建真核表达重组质粒pEGFP-N1-DNMT1，将重组载体转染巨噬细胞24h后，在荧光显微镜下观察到巨噬细胞内表达大量的绿色荧光蛋白。real-time PCR结果显示pEGFP-N1-DNMT1组DNMT1mRNA表达显著高于正常对照组和pEGFP-N1组，Western blotting检测DNMT1蛋白的表达与其mRNA表达一致。ntMS-PCR法检测EC-SOD DNA甲基化结果显示，100μmol/LHcy组与正常对照组比较，甲基化程度降低了15.67%，pEGFP-N1-DNMT1组EC-SOD甲基化程度显著升高，分别较正常对照组和100μmol/LHcy组升高了1.16和1.38倍，pEGFP-N1-DNMT1+100μmol/LHcy组EC-SOD甲基化程度较pEGFP-N1-DNMT1组有所降低。结论Hcy通过干扰甲硫氨酸循环途径，改变基因DNA的甲基化修饰状态，其中在转甲基过程中发挥关键作用的酶DNMT1发生改变，引起了EC-SOD基因DNA甲基化程度的降低，使得EC-SOD mRNA和蛋白表达上调。成功构建真核表达重组质粒pEGFP-N1-DNMT1，脂质体转染巨噬细胞，DNMT1高表达，导致EC-SOD甲基化程度增加，表明DNMT1在EC-SOD甲基化改变中的起关键调控作用，为AS的靶向性治疗提供了可能的潜在靶点。

全文目录


摘要  4-7
ABSTRACT  7-10
符号说明  10-13
前言  13-19
  参考文献  17-19
第一部分 EC-SOD DNA 甲基化在 HHcy 致 ApoE~(-/-)鼠动脉粥样硬化中的作用  19-50
  引言  19-21
  材料与方法  21-38
  结果  38-45
  讨论  45-48
  参考文献  48-50
第二部分 Hcy 致 THP-1 单核细胞源性巨噬细胞中 EC-SOD 甲基化的改变及其机制研究  50-67
  引言  50-51
  材料与方法  51-59
  结果  59-64
  讨论  64-66
  参考文献  66-67
全文总结  67-68
综述  68-80
  综述参考文献  75-80
致谢  80-81
攻读学位期间发表的学术论文  81-82
个人简历  82

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 心脏、血管（循环系）疾病 > 血管疾病 > 动脉疾病
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